기증자 심장 보존 전략을 테스트하기 위해 격리된 작업 쥐 심장 모델 사용

요약

기증자 심장 보존 전략을 테스트하기 위한 생체 외 격리 작업 쥐 심장 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 논문은 설치류 기증자 심장의 정적 냉장 보관에 사용하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 그러나 이 프로토콜은 순환사 및 뇌사 후 기증 후 얻은 기증자의 심장에도 사용할 수 있습니다.

초록

기증자 심장 보존 솔루션의 최적화는 장기 채취, 운송 및 이식 중 기증자 심장의 허혈 재관류 손상을 줄이는 데 중요한 역할을 했습니다. 우리 실험실의 이전 연구에 따르면 기증자 심장 보존 용액에 글리세릴 트리나이트레이트와 에리트로포이에틴을 추가하면 장기간 냉장 보관 후 및 순환성 사망 후 심장 기증 시 심장 기능 회복이 크게 향상될 수 있습니다. 이 보충제 프로토콜은 호주, 벨기에 및 영국 전역의 이식 병동에서 임상적으로 구현되었습니다. 여기에서는 IWRH(ex vivo isolated working rat heart) 관류 회로를 사용하여 보충제 전략을 테스트하기 위한 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 이 방법론을 사용하여 보충 전략은 장기간 저온 정적 보관, 뇌사 후 기증 및 순환 사망 후 기증 기증자의 심장 보존의 맥락에서 테스트할 수 있습니다. 대동맥 흐름, 관상 동맥 흐름, 심박출량, 맥압 및 심박수로 측정한 심장 기능 회복은 특정 보존 전략이 기증자 심장의 허혈 재관류 손상을 최소화할 수 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

심장 이식의 성공 여부는 기증자의 심장에 사용되는 보존 방법에 따라 크게 영향을 받을 수 있습니다. 기증자의 심장은 장기 채취, 이송 및 이식 과정 전반에 걸쳐 허혈성 모욕을 당합니다. 기증자 장기에 대한 허혈성 손상의 정도는 적절한 기증자 심장 보존 전략을 선택함으로써 완화할 수 있습니다. 저온 정적 보관(CSS)은 기증자의 심장 보존을 위한 가장 실현 가능하고 일반적인 방법으로 남아 있습니다. 그러나 CSS가 모든 심장 기증 경로에 반드시 최선의 선택은 아닐 수 있습니다. 예를 들어, 순환사 후 기증(DCD) 경로를 통해 조달한 심장은 정상 보온 기계 관류를 사용하여 유지 및 생존 가능성을 평가하는 반면, 뇌사 후 기증(DBD) 경로를 통해 조달한 심장은 CSS 또는 저체온 기계 관류를 사용하여 보존할 수 있습니다. 사용된 보존 전략의 또 다른 중요한 결정 요인은 장기 조달 및 운송 중에 심장이 받는 온열 허혈(DCD의 경우) 또는 한랭 허혈(DBD의 경우)의 양입니다.

많은 센터에서는 허혈성 내성을 높이고 이식 후 심장 기능을 개선하기 위해 심장 보존 용액의 추가적인 약리학적 보충제를 사용합니다. 우리 실험실의 설치류 연구에 따르면 에리트로포이에틴과 글리세릴 트리니트레이트로 마비를 보충하면 기증자 심장을 장기간 냉장 보관한 후 심장 기능 회복을 크게 개선할 수 있었습니다 ^1,2. 그런 다음 이러한 연구는 기증자의 심장 보존에 대한 돼지 연구로 진행되었으며 정상 발열 기계 관류 ^3,4,5를 사용하는 DCD 경로를 통해 조달된 심장의 심정지 용액에 에리트로포이에틴과 글리세릴 트리니트레이트를 통합하도록 이끈 전임상 기초를 제공했습니다. 현재 에리스로포이에틴(erythropoietin)과 글리세릴 트리니트레이트(glyceryl trinitrate)를 보충하는 것은 CSS를 통합한 임상 DBD 심장 채취를 위한 호주 이식 병동에서도 사용됩니다. 아래에 설명된 IWRH(Isolated Working Rat Heart) 관류 프로토콜의 전반적인 목표는 실험실 환경에서 기증자 심장 보존 전략을 테스트하고 재관류 후 기증자 심장 기능을 보존하기 위한 효능을 테스트하는 것입니다. 설명된 격리된 작업 쥐 심장 프로토콜은 우리 실험실에서 20년 이상 사용되어 왔으며 기증자의 심장 보존을 개선할 수 있는 잠재적인 보충제 및/또는 전략을 스크리닝하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다 2,7,8,9.

프로토콜

모든 동물은 호주 국립보건의료연구위원회(National Health and Medical Research Council, Australia) 지침에 따라 인도적인 치료를 받았습니다. 모든 동물 시술은 Garvan Institute of Medical Research(호주 시드니)의 동물 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. Krebs-Henseleit(KH) 완충액의 제조

1. 2.36 M NaCl, 0.094 M KCl, 0.024 M MgSO₄, 0.024 M KH₂PO_{4 를} 포함하는 KH 완충액의 20x 스톡 용액 2 L를 준비합니다. 50mL 튜브에 분취하여 -20°C에서 보관합니다.
2. 실험에 앞서 1900mL의 탈이온수, 100mL의 20x 스톡 KH 완충액, 4.20g의 NaHCO₃ (25mM) 및 3.96g의 포도당(11mM)을 포함하는 1x KH 완충액의 2L Erlenmyer 플라스크 2개를 준비합니다.
   1. 버퍼 플라스크를 37°C 수조에 넣고 에어 스톤(슬립온 입구 필터)을 통해 카보겐(95% 산소, 5% 이산화탄소, 2L/min으로 설정된 유속)으로 용액을 5분 동안 가스화한 다음 2.8mL의 1M CaCl₂ (1.4mM)를 추가합니다. 실험을 시작하기 최소 1시간 전에 용액을 계속 버블링합니다. 에어 스톤을 사용하면 완충액의 균일한 통기에 도움이 됩니다.
   2. -20°C의 둥근 금속 접시에 소량(~50mL)의 완충액을 넣어 냉각하고 얼음 완충액 층을 형성합니다.

2. 관류 회로의 준비

1. 모든 튜브와 유리 제품이 눈에 띄는 성장/오염 없이 깨끗한지 확인하십시오.
2. 1cm H₂O가 1.36mmHg에 해당하므로 필요한 관류 압력에 해당하는 유리 챔버의 높이를 설정합니다: Langendorff-to-heart 100cm(약 75mmHg), 예압 작업 좌-심 15cm(약 11mmHg), 심압-후부하 챔버 100cm(약 75mmHg).
3. 심장 관류 최소 10분 전에 회로 주변에 뜨거운 물 순환을 시작하십시오.
4. 극세사 필터(1.2μm)를 필터 홀더에 넣고 단단히 고정합니다.
5. KH 버퍼로 회로를 프라이밍하여 모든 공기가 제거되도록 하고 유량 제어 튜브 클램프를 사용하여 Langendorff 측(그림 1A, B)의 유량을 ~50mL/분으로 조정합니다. 흐름이 느리면 대동맥 캐뉼레이션이 쉬워지고 묶기 전에 심장이 빠지는 것을 방지할 수 있습니다. T자형 튜브 커넥터를 통해 회로 내에 온도계를 배치하여 ~37°C에서 버퍼의 온도를 모니터링합니다.

3. Lab Chart(데이터 분석) 소프트웨어 설정

1. 데이터 분석 소프트웨어를 열기 전에 Powerlab(데이터 수집 시스템)과 유량계가 켜져 있고 컴퓨터에 연결되어 있는지 확인하십시오.
2. 새 파일을 엽니다.
3. 설정 드롭다운 메뉴를 선택하고 채널 설정을 선택하여 데이터 수집을 설정합니다. 대동맥 압력(Aortic Pressure), 대동맥 흐름(Aortic Flow) 및 심박수(Heart Rate)를 선택합니다(그림 2A).
4. 그림 2B에 표시된 설정으로 각 채널을 설정합니다.

4. 쥐 심장 격리를 위한 동물 준비

참고: 콜드 스태틱 보관을 위한 non-DBD 및 non-DCD 심장에 대한 쥐 심장 격리 및 관류 방법론은 아래에 설명되어 있습니다. 관류 회로에 심장 기구를 삽입하는 방법은 어떤 기증 방법을 사용하는지에 관계없이 비교적 유사합니다. DBD와 DCD 쥐의 심장 기증에 대한 프로토콜의 차이는 주로 동물 마취가 효력을 발휘한 시점부터 동물에서 심장을 절제할 때까지 발생합니다.

1. 동물의 무게를 측정하여 무게가 >330g인지 확인하십시오. 수컷 쥐의 이상적인 체중 범위는 330-420g입니다.
2. 케타민(80mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)의 복강내 주사를 투여합니다. 페달 반사(발가락 꼬집 반사)와 눈 깜박임 반사가 없는 경우 적절한 수술 마취면을 보장합니다.
3. 동물을 누운 자세로 놓고 팔다리를 테이프로 고정합니다. 노즈 콘을 통해 동물에게 산소를 투여합니다.
4. 해부 스테이션에서 KH 완충 얼음 슬러시 금속 용기와 얼음이 담긴 작은 금속 용기를 준비하십시오. 7.5cm x 7.5cm 거즈를 KH 버퍼에 담그고 얼음과 함께 용기에 놓습니다.
5. 적절한 수술 마취가 확인되면 수술 절개 부위의 피부를 면도하고 베타딘 또는 70% 알코올과 같은 무균제로 피부를 청소합니다. 복부를 가로질러 측면을 절개하고(개복술) 위와 장을 옆으로 움직여 왼쪽 신장 정맥에 접근할 수 있도록 합니다. 1500IU의 헤파린을 주입하고 출혈이 멈출 때까지 주사 부위에 압력을 가합니다. 심장 채취를 계속하기 전에 헤파린이 순환할 때까지 1-2분 동안 기다립니다.
6. 양쪽의 흉곽을 절단하고 횡격막을 가로질러 절단하여 흉강을 엽니다. 하행 대동맥을 따라 절단하면서 심장-폐 블록을 조심스럽게 잡고 들어 올려 대동맥궁이 손상되지 않도록 합니다. 이렇게 하면 캐뉼레이션을 위해 충분한 대동맥 길이가 유지될 수 있습니다.
7. 쥐는 마취 상태에서 심장과 폐를 제거하여 안락사됩니다. 심장이 멈출 수 있도록 KH 완충 얼음 슬러시에 심장-폐 블록을 담그십시오.

5. 고립된 작동 심장 관류 회로에 심장을 캐뉼러로 만들기

1. 심장-폐 블록을 얼음 위의 거즈에 옮깁니다. 대동맥 주변의 과도한 지방을 절개하고 대동맥을 다듬어 캐뉼레이션을 위해 3-5mm 길이로 남기고 폐동맥을 1~2mm 작게 절개합니다. 이렇게 하면 관상 동맥 유출물에 대한 경로를 허용할 수 있습니다.
2. 잘린 심장-폐 블록(얼음 위에 있는 동안)을 캐뉼라 바로 아래에 놓습니다. 대동맥 캐뉼레이션을 용이하게 하기 위해 유량 제어 튜브 클램프를 사용하여 Langendorff 쪽에서 흐름을 조정합니다. 대동맥을 왼쪽 캐뉼라에 조심스럽게 캐뉼러하고 검은색 클램프로 잡고 2-0 실크 봉합사로 묶습니다.
3. 유량 제어 튜브 cl을 완전히 열어 Langendorff 관류의 유량을 증가시킵니다.amp. 애프터로드 클램프를 엽니다. Langendorff 챔버에서 연속적인 흐름이 있는지 확인하십시오. 소프트웨어로 심장 활동 모니터링을 시작하세요.
   알림: 유량계 디스플레이의 대동맥 유량 값이 <10mL/min인 경우 폐동맥 절개술의 크기가 충분한지 확인하십시오. 낮은 대동맥 흐름 추적/값은 대동맥 캐뉼라가 너무 많이 삽입되었음을 나타낼 수도 있습니다.
4. 폐의 전방 표면이 작업자를 향하도록 심장-폐 블록을 조정합니다. 왼쪽 폐엽을 2-0 실크 봉합사로 묶고 여분의 왼쪽 폐 조직을 잘라냅니다. 나머지 폐엽을 2-0 실크 봉합사로 한 번에 묶고 조직을 자릅니다. 묶인 폐가 뒤쪽을 향하도록 심장을 회전시킵니다.
5. 작은 Vannas 가위를 사용하여 왼쪽 심방 부속기의 2-3mm 가장자리를 잘라 심방에 작은 구멍이 생기도록 합니다. 왼쪽 심방 부속기를 왼쪽 캐뉼라에 조심스럽게 캐뉼러하고 검은색 클램프로 잡고 2-0 실크 봉합사로 묶습니다. 그림 3A 는 두 캐뉼라의 배치를 보여줍니다.
6. 심장이 챔버 중앙 내에 오도록 심박실 워터 재킷을 조정합니다.
7. 압력 트랜스듀서를 열어 공기를 공급하고 대 동맥 압력 드롭다운 메뉴 > Bridge Amp > Zero를 선택하여 소프트웨어에서 압력 트랜스듀서를 영점 조정합니다. 확인을 클릭합니다.
8. Langendorff 모드에서 10분 동안 심장을 관류합니다. Langendoff 대동맥 흐름이 10-20mL/분(이상적으로는 20mL/분)으로 측정되는지 확인합니다.
9. 작업 모드를 전환하기 전에 Langendorff KH 버퍼 저장소의 에어 스톤(슬립온 입구 필터)이 작동 중인 KH 버퍼 저장소에 배치되었는지 확인하십시오.
10. 대동맥 캐뉼라로 이어지는 큰 클램프를 닫고 좌심방 부속기로 이어지는 흐름을 열어 심장을 작동 모드로 전환합니다. 작업 관류액에서 이어지는 3방향 탭을 엽니다. 공통 리턴 튜브(KH 버퍼를 저장소로 다시 가져감)를 Langendorff 저장소에서 작업 저장소로 옮깁니다.
11. 15분 동안 작동 모드에서 심장을 관류합니다. 대동맥 흐름량 값은 15분 관류가 끝날 때 >30mL/분이 이상적이어야 합니다. 심장이 안정되면 데이터 분석 소프트웨어에서 데이터 기록을 시작합니다.
12. 관상동맥 유출물(관상동맥 흐름)을 1분, 5분, 10분, 15분으로 측정합니다.
    참고: 관상동맥 유속 값은 10-20mL/분 사이여야 합니다. 22mL/min 이상의 관상동맥 혈류는 일반적으로 묶이지 않은 폐혈관에서 누출이 발생했음을 나타냅니다. 심박수는 200-300bpm 사이여야 합니다. 관상동맥 폐수는 조직 손상 마커(예: 트로포닌-I, 젖산 탈수소효소 방출)의 다운스트림 분석을 위해 수집할 수 있습니다.

6. 심장의 차가운 정적 저장을 위한 심정지 관리

1. 심정지 챔버(약 40mmHg의 관류 압력을 얻기 위해 60cm 높이에 위치)를 지정된 심장 보존 용액 50mL(보충제 포함 또는 제외)로 채웁니다.
2. 워터 재킷을 내리고 작업 모드 쪽의 3방향 탭을 닫습니다.
3. 클램프를 닫아 왼쪽 심방 캐뉼라를 향한 흐름을 멈춥니다.
4. 대동맥 캐뉼라로 가는 흐름을 엽니다.
5. 클램프를 Langendoff 쪽과 애프터 로드에서 닫습니다.
6. 심정지 라인에서 클램프를 열고 압력 라인에서 15mL의 심정지를 씻어냅니다. 압력 라인에서 탭을 닫습니다.
7. 대동맥 캐뉼라를 통해 심장이 심정지로 씻겨지도록 하고 관상 동맥 유출물을 수집합니다. 3분 동안 심정지를 실행하고 투여된 심정지의 양을 기록합니다.
8. 소프트웨어에서 데이터 기록을 중지하고 파일을 저장하십시오.
9. 3분 후 심정지 클램프와 대동맥 캐뉼라로 이어지는 작은 파란색 클램프를 닫습니다.
10. 대동맥 캐뉼라에 불독 클램프를 놓고 왼쪽 캐뉼라에 두 번째 불독 클램프를 놓습니다. 회로에서 심장 캐뉼라 블록을 분리하고 아이스 박스에 담긴 심정지가 들어 있는 비커에 넣습니다(그림 3B, C).
11. 심장을 냉장고에 6시간(또는 원하는 냉장 보관 시간) 동안 보관하십시오.

7. 찬 정체되는 저장 후에 심혼 재관류

1. 섹션 1에 따라 KH 버퍼를 준비합니다.
2. 섹션 2에 따라 관류 회로를 프라임합니다.
3. 베이스라인 관류에서 저장된 파일을 엽니다.
4. 아이스 박스에서 심장 캐뉼라 블록을 조심스럽게 제거하고 관류 회로에 고정합니다. 대동맥 캐뉼라를 다시 연결하기 전에 KH 완충액으로 채워진 뭉툭한 끝 18G 주사기를 사용하여 캐뉼라에서 공기를 제거합니다. 대동맥 캐뉼라를 먼저 연결하고 Langendorff 쪽의 튜빙 클램프를 열고 후하중 튜빙 클램프가 열려 있는지 확인합니다.
5. 왼쪽 심방 캐뉼라를 다시 연결하고 관류 회로에 연결하기 전에 캐뉼라에서 공기가 제거되었는지 확인합니다. 작업측 cl을 유지하십시오.amp Langendorff에서 작업 모드로 전환할 때까지 닫혀 있습니다.
6. Langendorff 모드에서 15분 동안 심장을 관류합니다. Langendorff 재관류가 시작될 때 데이터 기록을 시작해야 합니다.
7. 작업 모드로 전환하기 전에 두 버블링 스톤을 KH 버퍼에 넣고 작업 측의 3방향 탭을 연 다음 공통 리턴 튜브를 작업 저장소로 옮깁니다.
8. 흰색 Langendorff 클램프를 닫고 흰색 작업면 클램프를 열고 30분 동안 심장을 관류합니다. 다운스트림 분석을 위해 지정된 시점에서 관상동맥 유출물을 측정하고 수집합니다(예: 심장 손상 마커). 소프트웨어 녹화를 중지-다시 시작하여 새 세그먼트를 시작해야 합니다(또는 주석 추가).
9. 약 15분 작업 모드 재관류에서 3방향 탭을 닫습니다.
10. 재관류가 끝나면 데이터 저장 file, 회로를 통한 흐름을 중지하고 심장 블록을 분리합니다. 조직학적 처리를 위해 좌심실 샘플을 수집하거나 향후 연구를 위해 스냅 냉동합니다(예: 웨스턴 블롯 연구를 위한 단백질 추출).
11. 필터 홀더에서 필터를 제거하고 회로에서 버퍼를 배출한 다음 증류수 5L로 두 번 씻어냅니다.
    알림: 필수는 아니지만 수조 내의 큰 용기에 담긴 증류수를 미리 데우는 데 도움이 됩니다.

8. 기능 회복 분석

1. LabChart 파일을 엽니다.
2. 최소 30초 동안 녹화할 수 있는 영역을 강조 표시한 다음 Command > Add data selection(데이터 선택 추가) 또는 Multiple add to data(여러 데이터에 추가)를 클릭합니다. 이렇게 하면 원하는 매개변수가 소프트웨어 내의 DataPad 파일에 추가됩니다.
3. DataPad> 창 드롭다운 메뉴를 선택합니다.
4. 기능 복구 분석을 위해 DataPad의 복구 값을 강조 표시하고 스프레드시트로 복사합니다. 기능 복구를 해당 기준 값 ^1,6,7의 백분율로 계산합니다.

결과

기준선 관류의 결과에 따라 초기 실험(사전 보관)이 성공적이었는지 여부가 결정됩니다. Langendorff 모드에서 표시되는 대동맥 흐름은 14 - 22 mL/min 사이여야 합니다. Langendorff 유량은 대동맥의 역행 관류로 인해 유량계에 음수 값으로 표시됩니다. 허용 가능한 Langendorff 추적의 예가 그림 4A에 나와 있습니다.

작동 모드로 전환되면 심...

토론

심장 기준선 기능의 민감한 특성을 감안할 때 관류 장비를 깨끗하고 호환되는 구성 요소로 유지하기 위해 주의를 기울여야 합니다. 예를 들어, 올바른 PVC 튜브를 사용해야 합니다. 실리콘과 같은 일부 튜브 재료는 대동맥 흐름과 수축력을 낮추는 데 기여할 수 있으며, 이는 튜브를 통한 산소 손실로 인한 것일 수 있습니다. 상업적으로 이용 가능한 고립된 작동 쥐 심장 관?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL colorless Eppendorff tube, 1000 per box	Bio Strategy Pty Ltd	0030.125.150
15 mL cent/tubes (S) Sleeve/25 PP ctn/500	Sigma-aldrich Pty Ltd	CLS430791-500ea
BP Transducer/Cable kit	ADInstruments	MLT1199	Data Acquisition
Bridge Amp	ADInstruments	FE221	Data Acquisition
Carbogen 555G2	BOC	BOC002
Checktemp1 thermometer	Hanna Instruments	HI98509	Rig Construction
Clamp Pinch 1/4-7/16 PK 12	Thomas Scientific	2848Y40	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Med.	Thomas Scientific	8847T08	Rig Construction
Clamp W/Extension Stem Sm.	Thomas Scientific	8847T02	Rig Construction
Clips, Vessel, 60 g Pressure	Coherent Scientific	14121	Surgical Equipment
Closed Connector	Thomas Scientific	8847E25	Rig Construction
Covidien Sofsilk 2-0 black precut 45 cm box of 24	Specialist Medical Supplies	S195	Surgical consumables
Custom Made 250 mL Jacketed Degasser	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
Custom Made 750 mL Reservoir	Custom Blown Glassware Pty Ltd	N/A	Rig Construction
D-(+)-Glucose Anhydrous SigmaUltra	Sigma-aldrich Pty Ltd	G7528-1Kg	To make Krebs Buffer
Dual Channel Console	ADInstruments	TS402	Data Acquisition
Erlenmyer flasks 2 L
Filter Microfibre type GF/C glass fibre 47 mm, 100	Bio-strategy Pty Ltd	1822047
Forceps, 15 cm, 0.3 mm, CRVD	Coherent Scientific	14114	Surgical Equipment
Four Prong Clamps with 9 mm x 115 mm long arm for holding 2-70 mm diam objects. Vinyl coated	Met-App Australia Pty Ltd	1352	Rig Construction
Heater Circulator. Digital Solid State Control. (1020 Watts/240 Volts)	Thermoline Scientific	TU3	Rig Construction
Heparin 5000 U/5 mL box 50 Pfizer 02112115	Clffird Hallam Healthcare Pty Ltd	1258693	Drugs
Ilium Xylazil 20 Inj 50 mL	Cenvet Australia Pty Ltd	X5010	Anaesthetic
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Coherent Scientific	CS-WPI-14117
Ketamine 100 mg/50 mL	Provet (NSW) Pty Ltd	KETAI1	Anaesthetic
Magnesium Sulphate heptahydrate AR 500 g Chemsupply	Bio Strategy Pty Ltd	MA048-500g	To make Krebs Buffer
Male/Female Hinged Adapter	Thomas Scientific	8847V08	Rig Construction
Masterflex L/S Easy-Load Head for Precision Tubing, PPS, CRS Rotor	John Morris	1015164	Rig Construction
Metzenbaum scissors, 11.5 cm curved	Coherent Scientific	WPI-501748	Surgical Equipment
Metzenbaum scissors, 14.5 cm straight	Coherent Scientific	WPI-501252	Surgical Equipment
Mounting Hardware F/2-HEADS SS	John Morris	1014414	Mounting screws for pump heads
Open-sided connector	Thomas Scientific	8847E05	Rig Construction
Paraformadehyde	Sigma-Aldrich	P6148-500G	Sample processing
Potassium Chloride (AnalaR NORMAPUR) 500 g	VWR Chemicals	26764.26	To make Krebs Buffer
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich Pty Ltd	P5379-500g	To make Krebs Buffer
Powerlab 2/26, 2 channel recorder + Labchart software	ADInstruments	ML826	Computer Hardware and Software
Precision XN Inline Flowsensor, 3.2 mm (1/8")ID ME4PXN-KR37 XF	ADInstruments	ME4PXN	Rig Construction
Scalpel with handle disposable #11 pkt/10	BSN Medical (Aust) Pty Ltd	73252-36
Silicone Gasket for Swinnex 47 mm 5/PK	Merck Millipore	SX0004701	Rig Construction
Silicone O-Ring 5-329 10/PK	Merck Millipore	XX1104707	Rig Construction
Single Buret Clamp	Thomas Scientific	8847T32	Rig Construction
Slip-on inlet Filter pore size 10 µm (bubbler)	Sigma-aldrich	59277	Rig Construction
Sm. 360 Rotation Connector	Thomas Scientific	8847E35	Rig Construction
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Pty Ltd	S6297 - 250g	To make Krebs Buffer
Swinnex Filter Holder, 47 mm	Merck Millipore	SX0004700	Rig Construction
syringes 1 mL box/100	Becton Dickinson Pty Ltd	302100
Three Prong Clamps with 9 mm diameter x 125 mm long arm and twin screw for holding 5-80 mm	Met-App Australia Pty Ltd	1356	Rig Construction
Tubing Flowmeter Module TS410	ADInstruments	TS410	Data Acquisition
Tubing PVC 6.35 mm ID x 9.52 mm OD 50ft Roll 15.24m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0600	Rig Construction
Tubing PVC 7.94mm ID x 11.1mm OD 50ft Roll 15.24 m, clear , DEHP phthalate free, food grade meets REAC	Thermo Fisher	NAL 8701-0900	Rig Construction
Tubing PVC 9.52 mm ID x 12.7 mm OD 100ft Roll	Thermo Fisher	NAL 8701-4120	Rig Construction
Vannas scissors, 8.5 cm, Straight, 7 mm Blades	Coherent Scientific	WPI-500-086	Surgical Equipment
Water Bath 30 Litre with Suspended Tray	Thermoline Scientific	TLWB-30	Rig Construction