نهج لبناء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع من تربة الجذور

Summary

يتم تقديم إجراء سريع وموحد لإنشاء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع التآزرية من مختلف أنواع تربة الجذور هنا. إنه بروتوكول فريد مصمم لسبر ومحاكاة ميكروبيوتا التربة الجذرية المعقدة.

Abstract

الأغشية الحيوية متعددة الأنواع هي نمط حياة طبيعي ومهيمن للبكتيريا في الطبيعة ، بما في ذلك في تربة الجذور ، على الرغم من أن الفهم الحالي لها محدود. هنا ، نقدم نهجا لإنشاء مجتمعات بيوفيلم تآزرية متعددة الأنواع بسرعة. الخطوة الأولى هي استخراج الخلايا من تربة الجذور باستخدام طريقة الطرد المركزي التفاضلي. بعد ذلك ، يتم تلقيح خلايا التربة هذه في وسط الاستزراع لتشكيل غشاء حيوي حبيبي. بعد 36 ساعة من الحضانة ، يتم تحديد التركيب البكتيري للغشاء الحيوي والمحلول الموجود تحته باستخدام طريقة تسلسل amplicon الجيني 16S rRNA. وفي الوقت نفسه ، يتم إجراء عزل بكتيري عالي الإنتاجية من الغشاء الحيوي للحبيبات باستخدام طريقة التخفيف الحد. بعد ذلك ، يتم اختيار أفضل 5 أصناف بكتيرية بأعلى وفرة في بيانات تسلسل amplicon الجيني 16S rRNA (عينات الأغشية الحيوية الحبيبية) لاستخدامها مرة أخرى في بناء مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع. تم إنشاء جميع مجموعات الأصناف البكتيرية ال 5 بسرعة باستخدام صفيحة من 24 بئرا ، تم اختيارها لأقوى قدرة على تكوين الأغشية الحيوية بواسطة مقايسة تلطيخ البنفسج البلوري ، وتم تحديدها كميا بواسطة qPCR. وأخيرا، تم الحصول على أقوى تجمعات الأغشية الحيوية البكتيرية متعددة الأنواع الاصطناعية من خلال الطرق المذكورة أعلاه. توفر هذه المنهجية إرشادات إعلامية لإجراء البحوث حول الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور وتحديد المجتمعات التمثيلية لدراسة المبادئ التي تحكم التفاعلات بين هذه الأنواع.

Introduction

تمثل الأغشية الحيوية مجتمعات ميكروبية معقدة إما مثبتة على الأسطح أو مرتبطة بواجهات بينية. هناك اعتراف واسع النطاق بأن غالبية البكتيريا التي تصادف في بيئات مختلفة ، مثل الموائل الطبيعية والبيئات السريرية والسياقات الصناعية ، تدوم داخل مجتمعات الأغشية الحيوية¹. في التربة ، يشكل الريزوسفير - الذي يشمل سطح الجذر والمنطقة المجاورة له التي يبلغ سمكها 2 مم - مكانة بيئية مع توافر المغذيات المتزايدة. طورت بكتيريا معينة استراتيجيات لاستغلال هذا المكان المناسب ، وتعزيز انتشار الميكروبات وتعزيز تكوين مجتمعات الأغشية الحيوية في الجذور².

تعتبر ميكروبات الجذور "الجينوم الثاني" للنباتات³. تشارك الكائنات الحية الدقيقة المعززة لنمو النبات (PGPM) في التعايش المتبادل مع النباتات ، مما يوفر وظائف كبيرة لتعزيز النمو والمكافحة الحيوية⁴. من ناحية ، يمكن ل PGPM توفير العناصر الغذائية لجذور النباتات ، وتعزيز امتصاص المغذيات ، والدفاع ضد مسببات الأمراض ، وتحلل الملوثات في تربة الجذور⁵. من ناحية أخرى ، يستخدم PGPM إفرازات جذور النبات كمصدر غذائي للنمو والتطور ، وبالتالي التأثير على تربة الجذور ونظام الجذر من خلال عملية التمثيل الغذائي الخاصة بهم. تجدر الإشارة إلى أن الشرط الأساسي لجميع هذه الوظائف هو الاستعمار الفعال ل PGPM في جذور النبات ، وتشكيل الأغشية الحيوية^{المستقرة 6}.

يؤثر الأغشية الحيوية للجذمور على عملية تجميع ميكروبات الريزوسفير ، وترتبط الخصائص الزمنية والمكانية لتجميع ميكروب الجذور ارتباطا وثيقا بتفاعل الأغشية الحيوية^{متعددة الأنواع 7}. إنه بمثابة محور لتفاعلات الميكروبيوم النباتي ، مما يوفر مكانا مستقرا ويمكن التحكم فيه للتفاعل بفعالية. لذلك ، تعد دراسة الأغشية الحيوية للجذور اتجاها مهما لاكتساب نظرة ثاقبة للتفاعل بين النباتات والميكروبات.

ومع ذلك ، لا يوجد حاليا سوى القليل من الأبحاث حول الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور. التعقيد العالي لتكوين الميكروبيوم يجعل من الصعب الإجابة على الأسئلة البيئية الأساسية المحيطة بالمجتمعات الميكروبية الطبيعية⁸. في عملية التجارب ، يجب مراعاة العديد من الظروف ، مثل نوع التربة ونوع النبات والعدد الكبير من المجتمعات الميكروبية. هناك عوامل مختلفة تحد من البحث في الأغشية الحيوية متعددة الأنواع في الجذور.

لمزيد من التحقيق في مجتمعات الأغشية الحيوية متعددة الأنواع من تربة الجذور ، مثل التفاعلات التآزرية بين الأنواع أو التغذية المتقاطعة للمستقلب⁸ ، من المستحسن بناء مجتمع ميكروبي اصطناعي مبسط وتمثيلي ومستقر وقابل للتتبع في ظل ظروف المختبر ^9,10. هنا ، يجمع بروتوكول موحد بين العديد من أحدث التقنيات الميكروبيولوجية والمعلوماتية الحيوية.

Protocol

ينطبق هذا البروتوكول بشكل عام على ميكروبيوتا التربة الجذرية من النباتات المختلفة. هنا ، يتم استخدام الخيار كمثال. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة للدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. العزلة البكتيرية

1. عزل التربة الجذرية
   1. ثقافة الخيار
      1. تطهير بذور الخيار مع 75 ٪ من الإيثانول و 2 ٪ من محلول هيبوكلوريت الصوديوم (NaClO) ، ثم شطفها في الماء المعقم¹¹.
      2. تنبت البذور في ظل ظروف معقمة واختيار تلك التي تصل إلى المرحلة المكونة من ورقتين¹². بعد ذلك ، قم بزرع شتلات الخيار المنبثقة باستمرار في أواني تحتوي على 2 كجم من التربة السوداء.
         ملاحظة: يتم استخدام نوعين من التربة السوداء من مواقع مختلفة في شمال شرق الصين لتقليل الأخطاء المنهجية.
   2. إعداد تعليق التربة
      1. تحضير المخزن المؤقت PBS-S باستخدام التركيبة: 6.33 جم من NaH₂PO₄ · H₂O ، 16.5 جم من Na₂HPO₄ · 7H₂O ، 200 ميكرولتر من Silwet L-77 ، و 1 لتر ماء مقطر.
      2. عندما تصل الشتلات إلى المرحلة¹² المكونة من أربع أوراق ، اقلب الوعاء واعزل الجذور مع تربة جذرية بسمك 2 مم باستخدام قفازات معقمة.
      3. ضع الجذور في 30 مل من المخزن المؤقت PBS-S في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل. بعد الهز لمدة 20 دقيقة ، قم بتصفية التعليق من خلال مرشح خلية نايلون 100 ميكرومتر لإزالة الجذور والرواسب الكبيرة.
      4. انقل المرشح إلى أنبوب طرد مركزي آخر سعة 50 مل ، وطرده مركزيا عند 3200 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وقم بتخزينه مؤقتا عند 4 درجات مئوية.
2. استخراج الخلايا البكتيرية في التربة الجذرية.
   ملاحظة: تعتمد هذه المنهجية طريقة الطرد المركزي التفاضلي¹³ ، على الرغم من أن طريقة الطرد المركزي المتدرج الكثافة^{Nycodenz 14} تنطبق أيضا على هذه الخطوة.
   1. قم بتخفيف تعليق التربة بمحلول 0.2٪ Na₄P₂O₇ إلى 500 مل وأجهزة طرد مركزي عند 1000 × جم لمدة 10 دقائق لفصل الكائنات الحية في البداية عن التربة.
   2. أعد تجانس الراسب ، وطرده بنفس السرعة المنخفضة لمدة 60 ثانية ، وكرر العملية ثلاث مرات. اجمع بين المواد الطافية ، وطردها مركزيا عند 12000 × جم لمدة 20 دقيقة ، ثم تخلص من المادة الطافية.
   3. إعادة تعليق الراسب في 50 مل من المخزن المؤقت PBS-S ، مما يشكل تعليق الخلايا البكتيرية في التربة الجذرية.

2. تسلسل وتحديد ميكروبيوتا الأغشية الحيوية للجذمور

1. الإعداد الإعلامي
   ملاحظة: مرق الصويا التربتيك (TSB) ووسائط الغلوتامات الغليسيرول الضئيلة (MSgg) متوفرة تجاريا. الصيغ الواردة أدناه هي للإشارة فقط.
   1. تحضير وسط مكتب تقييس الاتصالات باستخدام الصيغة التالية: 15 ميكروغرام/مل تريبتون، 5 ميكروغرام/مل ببتون الصويا، 5 ميكروغرام/مل كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني = 7.
   2. تحضير وسط MSgg باستخدام الصيغة التالية: 5 mM KH₂PO₄ ، 100 mM 3- (N-morpholino) حمض البروبان السلفونيك (MOPS) ، 2 mM MgCl₂ ، 700 μM CaCl₂ ، 50 μM MnCl₂ ، 50 μM FeCl₃ ، 1 μM ZnCl₂ ، 2 μM الثيامين ، 0.5٪ الجلسرين ، 0.5٪ الغلوتامات ، 50 ميكروغرام / مل التربتوفان ، 50 ميكروغرام / مل فينيل ألانين ، الرقم الهيدروجيني = 7.
   3. لإعداد وسائط TSB-MSgg، امزج وسائط TSB مع وسائط MSgg بنسبة 1:1 (v/v)¹⁵.
2. زراعة الأغشية الحيوية الحبيبية
   1. احتضان معلق الخلية في وسط TSB عند 30 درجة مئوية طوال الليل (عادة 12 ساعة) لتنشيط البكتيريا.
   2. ضع مرشحات خلايا النايلون 100 ميكرومتر على ألواح 24 بئرا. احتضان البكتيريا في وسائط TSB وإعداد ثلاث تكرارات. استزرع الغشاء الحيوي الحبيبي لمدة 36 ساعة عند 30 درجة مئوية.
      ملاحظة: إذا لم يكن الغشاء الحيوي الحبيبي من الخطوة الأخيرة مزروعا جيدا، فإن الوسط TSB-MSgg هو بديل فعال لوسط مكتب تقييس الاتصالات.
   3. قم بإزالة المرشح الذي يحتوي على الغشاء الحيوي الحبيبي. أضف 2 مل من المخزن المؤقت PBS-S إلى لوحة خلية جديدة مكونة من 24 بئرا ، ضع مرشح 24 بئرا فيه لغسل الغشاء الحيوي ، وإزالة الخلايا الحرة. كرر عملية الغسيل ثلاث مرات.
3. استخراج الحمض النووي للغشاء الحيوي الحبيبي
   1. استخرج جينوم الأغشية الحيوية باستخدام مجموعة الحمض النووي باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
4. تسلسل عالي الإنتاجية
   ملاحظة: يمكن لشركات التكنولوجيا الحيوية المساعدة في إكمال تجارب التسلسل لمعظم المختبرات. إذا كانت هناك حاجة إلى التركيب الميكروبي في المحلول المتبقي ، فقم بتسلسله في هذه الخطوة. تختلف خطوة التسلسل حسب الأدوات. يرجى اتباع تعليمات الشركة المصنعة. الخطوة 2.4.1 هي للإشارة فقط.
   1. تضخيم مناطق V3-V4 لجين 16S rRNA بناء على قاعدة البيانات ذات تسلسلات جينات 16S rRNA كاملة الطول. إنشاء أنواع OTUs وفقا للحد الأدنى لعدد التسلسلات لكل عينة¹⁶. تجميع شروح تصنيف الأنواع والحصول على تركيبات المجتمعات من كل عينة.
   2. بناء على بيانات التسلسل ، حدد السلالات الخمس الأولى من حيث وفرتها النسبية.
5. عزل وثقافة بكتيرية عالية الإنتاجية
   ملاحظة: تم تصميم هذه الخطوة وفقا لأحدث منهجية ميكروبيولوجية ومعلوماتية حيوية¹⁷. تتوفر طريقة اللوحة المطلية بالتخفيف للعزل البكتيري هنا ، على الرغم من أنها تستغرق وقتا أطول وأقل استهدافا مقارنة بالتقنيات عالية الإنتاجية.
   1. خلط الأغشية الحيوية المزروعة. استخدم التخفيف المحدد لضمان عدم ظهور نمو البكتيريا في أكثر من 30٪ من الآبار في اللوحة المكونة من 24 بئرا.
      ملاحظة: لتحديد التخفيف الأنسب، قم بإجراء تجارب أولية باستخدام مجموعة واسعة من معدلات التخفيف. يجب ألا يحتوي التخفيف الأمثل على أكثر من اثنين من البكتيريا القابلة للزراعة لكل ملليلتر ، مما يمثل الحضانة البكتيرية في أقل من 30 ٪ من الآبار.
   2. تضخيم جين 16S rRNA للبكتيريا أثناء إضافة ملصقات للآبار والألواح وتسلسلها باستخدام منصة Illumina عالية الإنتاجية¹⁷.
   3. إجراء تحليلات المعلوماتية الحيوية باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا للحصول على معلومات النقاء وتصنيف الأنواع لكل مستزرع.
   4. قم بزراعة البكتيريا النقية الخمسة الأولى الوفيرة عن طريق زراعة الخط المستمر واستخدم الجلسرين للحفاظ على البكتيريا عند -80 درجة مئوية.

3. بناء المجتمعات الميكروبية الاصطناعية

1. إعادة بناء ثقافة الأغشية الحيوية الرقيقة
   ملاحظة: لمزيد من التفاصيل، يرجى الرجوع إلى Ren et ^al.18. تتوافق السلالات الخمس مع 31 تركيبة اصطناعية ، بما في ذلك 5 أنواع مفردة ، و 10 أنواع ، و 10 أنواع ثلاثية ، و 5 أربعة أنواع ، و 1 اتحادات من خمسة أنواع.
   1. احتضان السلالات ال 5 في وسط مكتب تقييس الاتصالات حتى يصل OD₆₀₀ إلى 1 لتنشيطها.
   2. قم بإعداد العديد من الألواح ذات 24 بئرا باستخدام وسيط TSB وضع مرشحات خلايا نايلون 100 ميكرومتر عليها.
      ملاحظة: إذا لم يكن الغشاء الحيوي من الخطوة الأخيرة مستزرعا جيدا، فإن وسيط TSB-MSgg هو بديل فعال لوسط مكتب تقييس الاتصالات.
   3. احتضان 31 مجموعة من المجتمعات الاصطناعية في الوسط. تأكد من أن عدد تلقيح البكتيريا ثابت في كل بئر. قم بإعداد ثلاثة تكرارات لكل مجموعة.
   4. زراعة الأغشية الحيوية عند 30 درجة مئوية لمدة 36 ساعة.
2. القياس الكمي للغشاء الحيوي الحبيبي
   1. اتبع نفس الإجراء كما في الخطوة 2.2.3.
   2. انقل الغشاء الحيوي إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على 180 ميكرولتر من محلول الكريستال البنفسجي وقم بتلطيخها لمدة 20 دقيقة.
   3. انقل العينة الملطخة إلى صفيحة أخرى مكونة من 24 بئرا تحتوي على 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 96٪ ، وقم بإزالتها لمدة 30 دقيقة ، وقم بقياس OD₅₉₀.

4. تحديد عدد خلايا الكريات

ملاحظة: لتحديد نسبة كل نوع وعدد الخلايا في الحبيبات والمحلول المتبقي ، من الضروري إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي. لمزيد من التفاصيل ، راجع Sun et ^al.16.

1. تصميم مواد أولية خاصة بالسلالة للمجتمعات الميكروبية الاصطناعية المختارة.
2. استخدم Roary لإجراء مقارنات الجينوم ومعرفة جينات النسخة المفردة الخاصة بالسلالة لكل عزلة. تأكد من أن البادئات تستهدف هذه الجينات.
3. Ligase الشظايا المضخمة إلى بلازميدات PMD19T. قم بإنشاء منحنيات قياسية باستخدام البلازميدات التي تحتوي على الأجزاء المقابلة كقوالب.
4. اتبع نفس الخطوات المذكورة في الخطوة 2.2.
5. تحضير مكونات التفاعل على النحو التالي: 7.2 ميكرولتر من H₂O ، 10 ميكرولتر من 2x qPCR Master mix ، 0.4 ميكرولتر من 10 ميكرومتر من كل برايمر ، و 2 ميكرولتر قالب DNA.
6. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي في ظل الظروف التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، و 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، متبوعة بقطعة منحنى ذوبان قياسية.
7. أداء ستة مكررات بيولوجية لكل علاج.

النتائج

باتباع الإجراء المذكور ، لوحظت تدرجات كبيرة في قدرة تكوين الأغشية الحيوية من ميكروبيوتا التربة في جذور الخيار (الشكل 1). أكد تسلسل amplicon الأغشية الحيوية الأنواع الموجودة في الحبيبات (الشكل 2). استنادا إلى رسم الخرائط الحرارية لبيانات التسلسل ، تم اختيار الأن?...

Discussion

وفقا للبروتوكول ، يتم بناء سلسلة من مجتمعات الأغشية الحيوية الاصطناعية القوية متعددة الأنواع على أساس الكائنات الحية الدقيقة في تربة الجذور من نباتات مختلفة. باستخدام تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، يتم فك تشفير تكوين كل مجتمع بوضوح. تشير الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية إلى قو?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.