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  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

ここでは、さまざまな根圏土壌から相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを確立するための迅速かつ標準化された手順を紹介します。これは、複雑な根圏土壌微生物叢を調査し、シミュレートするために設計された独自のプロトコルです。

要約

マルチスピーシーズバイオフィルムは、根圏土壌を含む自然界のバクテリアの自然発生的で支配的なライフスタイルですが、現在の理解は限られています。ここでは、相乗的な多種バイオフィルムコミュニティを迅速に確立するためのアプローチを提供します。最初のステップは、示差遠心分離法を使用して根圏土壌から細胞を抽出することです。その後、これらの土壌細胞を培地に接種して、ペリクルバイオフィルムを形成します。インキュベーションの36時間後、バイオフィルムとその下の溶液の細菌組成を、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシング法を使用して決定します。一方、ペリクルバイオフィルムからのハイスループット細菌分離は、限界希釈法を使用して行われます。次に、16S rRNA遺伝子アンプリコンシーケンシングデータ(ペリクルバイオフィルムサンプル)で最も存在量の多い上位5つの細菌分類群を選択し、多種バイオフィルムコミュニティの構築にさらに使用します。5つの細菌分類群のすべての組み合わせは、24ウェルプレートを使用して迅速に確立され、クリスタルバイオレット染色アッセイによって最も強いバイオフィルム形成能力が選択され、qPCRによって定量されました。最後に、最も堅牢な合成細菌の多種バイオフィルムコミュニティを上記の方法で取得しました。この方法論は、根圏多種バイオフィルムの研究を行い、これらの種間の相互作用を支配する原理を研究するための代表的なコミュニティを特定するための有益なガイダンスを提供します。

概要

バイオフィルムは、表面に付着しているか、界面に結合している複雑な微生物群集を表しています。自然の生息地、臨床現場、産業環境など、さまざまな環境で遭遇する細菌の大部分は、バイオフィルムコミュニティ内で存続していることは広く認識されています1。土壌では、根の表面とそれに隣接する厚さ2 mmの領域を含む根圏は、栄養の利用可能性が高まった生態学的ニッチを形成します。特定の細菌は、このニッチを利用するための戦略を進化させ、微生物の増殖を促進し、根圏2でのバイオフィルムコミュニティの形成を促進しました。

根圏微生物は植物の「第2のゲノム」と考えられています3。植物生長促進微生物(PGPM)は、植物と共生し、生育促進と生物制御機能4を発現します。一方では、PGPMは植物の根に栄養素を供給し、栄養素の取り込みを促進し、病原体から防御し、根圏土壌の汚染物質を分解することができます5。一方、PGPMは、植物の根の滲出液を成長と進化の栄養源として利用し、それによって根圏の土壌と根系に独自の代謝を通じて影響を与えます。これらすべての機能の前提条件は、植物の根圏におけるPGPMの効果的なコロニー形成であり、安定したバイオフィルムを形成することであることは注目に値します6。

根圏バイオフィルムは根圏微生物の集合過程に影響を及ぼし、根圏微生物集合の時間的・空間的特性は多種バイオフィルムの相互作用と密接に関連している7。植物とマイクロバイオームの相互作用のハブとして機能し、植物が効果的に相互作用するための安定した制御可能なニッチを提供します。したがって、根圏バイオフィルムの研究は、植物と微生物の相互作用についての洞察を得るための重要な方向性でもあります。

しかし、現在、根圏の多種バイオフィルムに関する研究はほとんどありません。マイクロバイオームの構成は非常に複雑であるため、天然の微生物群集を取り巻く基本的な生態学的問題に答えることが難しくなっています8。実験の過程では、土壌の種類、植物の種類、多数の微生物群集など、多くの条件を考慮する必要があります。根圏マルチスピーシーズバイオフィルムの研究には、さまざまな要因が限界があります。

種間相乗相互作用や代謝物クロスフィーディング8など、根圏土壌からの多種バイオフィルムコミュニティをさらに調査するためには、実験室条件下で単純化された、代表的な、安定的で扱いやすい合成微生物コミュニティを人工的に構築することが望ましい9,10。ここでは、標準化されたプロトコルが、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス技術のいくつかを組み合わせています。

プロトコル

このプロトコルは、一般に、さまざまな植物からの根圏土壌微生物叢に適用できます。ここでは、キュウリを例に挙げます。本試験に使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1.細菌の分離

  1. 根圏土壌の分離
    1. キュウリの文化
      1. キュウリの種子を75%エタノールと2%次亜塩素酸ナトリウム(NaClO)溶液で消毒し、滅菌水ですすいでください11。
      2. 無菌条件下で種子を発芽させ、二葉ステージ12に達するものを選択します。その後、一貫して発芽したキュウリの苗を2kgの黒い土が入った鉢に移植します。
        注:システマティックエラーを減らすために、中国北東部の異なる場所からの2種類の黒土が使用されています。
    2. 土壌懸濁液の準備
      1. 製剤を使用してPBS-S緩衝液を調製します:6.33 gのNaH2PO4·H2O、16.5 g の Na2HPO4・7H2O、200 μL の Silwet L-77、および 1 L の蒸留水。
      2. 苗が四つ葉のステージ12に達したら、鉢を反転させ、滅菌した手袋を使用して、厚さ2mmの根圏土壌とともに根を分離します。
      3. 50 mLの遠心チューブに根を30 mLのPBS-Sバッファーに入れます。20分間振とうした後、懸濁液を100μmのナイロンセルフィルターでろ過し、根と大きな沈殿物を取り除きます。
      4. 濾液を別の50 mL遠心チューブに移し、室温で3200 x g で15分間遠心分離し、4°Cで一時的に保存します。
  2. 根圏土壌細菌細胞の抽出。
    注:この方法論は、示差遠心分離法13を採用していますが、Nycodenz密度勾配遠心分離法14 もこのステップに適用されます。
    1. 土壌懸濁液を0.2%Na4P2O7 溶液で500 mLに希釈し、1,000 x g で10分間遠心分離して、最初に生物を土壌から分離します。
    2. 沈殿物を再均質化し、同じ低速で60秒間遠心分離し、このプロセスを3回繰り返します。上清を結合し、12,000 x g で20分間遠心分離し、上清を捨てます。
    3. 沈殿物を50 mLのPBS-S緩衝液に再懸濁し、根圏土壌細菌細胞懸濁液を構成します。

2. 根圏バイオフィルム微生物叢のシーケンシングと同定

  1. メディアの準備
    注:トリプシン大豆ブロス(TSB)および最小塩グリセロールグルタミン酸(MSgg)培地は市販されています。以下の処方は参照用です。.
    1. 次の組成を使用してTSB培地を調製します:15 μg/mLトリプトン、5 μg/mL大豆ペプトン、5 μg/mL NaCl、pH = 7。
    2. 5 mM KH2PO4、100 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、2 mM MgCl2、700 μM CaCl2、50 μM MnCl2、50 μM FeCl3、1 μM ZnCl2、2 μM チアミン、0.5% グリセロール、0.5% グルタミン酸、50 μg/mL トリプトファン、50 μg/mL フェニルアラニン、 pH = 7です。
    3. TSB-MSgg メディアを調製するには、TSB メディアと MSgg メディアを 1:1 の比率 (v/v) で混合します15。
  2. ペリクルバイオフィルム共培養
    1. 細胞懸濁液をTSB培地で30°Cで一晩(通常は12時間)インキュベートして、細菌を活性化します。
    2. 100 μmナイロンセルフィルターを24ウェルプレート上に置きます。TSB培地で細菌をインキュベートし、3回の繰り返しを設定します。ペリクルバイオフィルムを30°Cで36時間培養します。
      注:最後のステップのペリクルバイオフィルムが十分に培養されていない場合、TSB-MSgg培地はTSB培地の効果的な代替品です。
    3. ペリクルバイオフィルムを含むフィルターを取り外します。新しい24ウェル細胞プレートに2mLのPBS-Sバッファーを加え、その中に24ウェルフィルターを入れてバイオフィルムを洗浄し、遊離細胞を除去します。洗濯を3回繰り返します。
  3. ペリクルバイオフィルムDNAの抽出
    1. 製造元の指示に従って、DNAキットを使用してバイオフィルムゲノムを抽出します。
  4. ハイスループットシーケンシング
    注:バイオテクノロジー企業は、ほとんどのラボでシーケンシング実験を完了するのを支援できます。残りの溶液中の微生物組成物が必要な場合は、このステップで配列決定します。シーケンシングステップは機器によって異なります。製造元の指示に従ってください。ステップ2.4.1は参照用です。
    1. データベースに基づいて、完全長の16S rRNA遺伝子配列を使用して、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を増幅します。サンプル16あたりの最小配列数に従って種OTUを作成します。種分類アノテーションをクラスター化し、各サンプルからコミュニティの組成を取得します。
    2. シーケンシングデータに基づいて、相対的な存在量の観点から上位5つの株を選択します。
  5. ハイスループットの細菌分離と培養
    注:このステップは、最新の微生物学的およびバイオインフォマティクス方法論17に従って設計されています。ここでは、希釈コーティングプレート法を細菌の分離に使用できますが、ハイスループット技術に比べて時間がかかり、ターゲットを絞る必要も少なくなります。
    1. 培養したバイオフィルムを混合します。24ウェルプレートのウェルの30%以上が細菌の増殖を示さないように、限界希釈を使用してください。
      注:最適な希釈を決定するには、幅広い希釈率を使用して予備実験を行います。最適な希釈には、1ミリリットルあたり2個以下の培養可能な細菌を含める必要があり、これはウェルの30%未満での細菌のインキュベーションに相当します。
    2. ウェルやプレートの標識を添加しながら、細菌の16S rRNA遺伝子を増幅し、ハイスループットのIlluminaプラットフォーム17を使用してそれらをシーケンシングします。
    3. 市販のソフトウェアを用いてバイオインフォマティクス解析を行い、各培養物の純度や種の分類情報を取得します。
    4. 上位5種類の豊富な純細菌を連続系統培養で培養し、グリセロールを使用して-80°Cで保存します。

3. 合成微生物群集の構築

  1. 再構築されたバイオフィルム培養
    注:詳細については、Ren et al.18を参照してください。5つの系統は、5つの単一種、10の2種、10の3種、5つの4種、および1つの5種のコンソーシアムを含む31の合成組み合わせに対応します。
    1. 5つの菌株をTSB培地でOD600 が1になるまでインキュベートして活性化します。
    2. TSB培地で24ウェルプレートを数枚調製し、その上に100 μmナイロンセルフィルターをセットします。
      注:最後のステップのバイオフィルムが十分に培養されていない場合、TSB-MSgg培地はTSB培地の効果的な代替品です。
    3. 培地中の31種類の合成コミュニティの組み合わせをインキュベートします。各ウェルで細菌の接種数が一貫していることを確認してください。組み合わせごとに 3 回の繰り返しを設定します。
    4. バイオフィルムを30°Cで36時間培養します。
  2. ペリクルバイオフィルムの定量化
    1. ステップ 2.2.3 と同じ手順に従います。
    2. バイオフィルムを180 μLのクリスタルバイオレット溶液を含む新しい24ウェルプレートに移し、20分間染色します。
    3. 染色したサンプルを、200 μL の 96% エタノールを含む別の 24 ウェルプレートに移し、30 分間溶出して OD590 を測定します。

4. ペリクル細胞数の定量化

注:各種の割合とペリクルおよび残りの溶液中の細胞数を決定するには、定量的PCRが必要です。詳細については、Sun et al.16を参照してください。

  1. 選択した合成微生物群集の菌株特異的プライマーを設計します。
  2. Roaryを使用してゲノム比較を行い、各分離株の株特異的な単一コピー遺伝子を見つけます。プライマーがこれらの遺伝子を標的にしていることを確認してください。
  3. 増幅されたフラグメントをPMD19Tプラスミドにリガーゼします。対応するフラグメントを含むプラスミドをテンプレートとして使用して、標準曲線を生成します。
  4. ステップ 2.2 で説明したのと同じ手順に従います。
  5. 反応成分は、7.2 μLのH2O、10 μLの2x qPCR Masterミックス、各プライマーの10 μMの0.4 μL、および2 μLのテンプレートDNAを調製します。
  6. リアルタイムPCR装置を用いて、95°Cで10分間、95°Cで30秒間、60°Cで45秒間のサイクルを行い、その後、標準的な融解曲線セグメントを経る条件でPCRを実行します。
  7. 各治療に対して6回の生物学的複製を行います。

結果

上記の手順に続いて、キュウリの根圏土壌微生物叢からのバイオフィルム形成能力の有意な勾配が観察されます(図1)。バイオフィルムアンプリコンシーケンシングにより、ペリクル中の種が確認されました(図2)。シーケンシングデータのヒートマッピングに基づいて、ペリクル内の存在量が残りの溶液中の細菌種よりも大きい上位5つの細菌種が選...

ディスカッション

プロトコルに従って、一連の堅牢な合成多種バイオフィルムコミュニティが、さまざまな植物の根圏土壌中の微生物叢に基づいて構築されます。定量的PCR技術を用いて、各コミュニティの構成を明瞭に解読します。バイオフィルムのバイオマスは、それらの潜在的な代謝相互作用の強さを示しているが、協力の背後にあるさまざまな特性やメカニズムはここでは明らかにできなかった

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(42307173および42107328)および国家重点研究開発プログラム(2022YFD1500202および2022YFF1001800)によって財政的に支援されました。P.W.、Z.Xが研究を設計しました。P.W、B.X、Z.C、J.X、N.Zがデータを分析し、数値を作成しました。P.W.は原稿の初稿を書きました。Z.X.、R.Z.、Q.S.が原稿を改訂しました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 % Na4P2O7 solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.20041418Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell FilterSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.F613463-0001Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.L03336903Used to sterilize the seeds.
24-well PlateMerck & Co., Inc.PSRP010Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)Bioolook Scientific Research Special2360010Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge TubeBeijing Su-bio Biotech Co., Ltd.62.547.254Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.801769680Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA KitNanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.D3350020000K04U021Used to extract bacterial DNA.
Black Soil INanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Jilin Province.
Black Soil IINanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10035048Used to prepare MSgg media.
CentrifugeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.G508009-0001High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co.,Ltd.Q311-02Used for DNA amplification in qPCR.
Clean BenchSuzhou Antai Airtech Co., Ltd.NB026143Used for aseptic operation.
Constant Temperature IncubatorShangHai CIMO Medical Instrument Co.,LtdGNP-9080BS-figure-materials-2598Used for microbial cultivation.
Cristal Violet DyeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.A600331Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber SeedNanjing Agricultural UniversityN/A"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of SciencesN/AUsed for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011918Used to prepare MSgg media.
FridgeHefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.BCD-556WKPM(Q)Used for strain preservation.
GlutamateBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010618Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting BasketYulv Furniture Store6526262626Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4Xilong Scientific Co.,Ltd.10017618Used to prepare MSgg media.
MgCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.7791186Used to prepare MSgg media.
MnCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10400101Used to prepare MSgg media.
Msgg MediumShanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.BES20791KBPellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2OMerck & Co., Inc.S9390-100GUsed to prepare TSB media.
NaCIChinasun Specialty Products co., Ltd.HS0416Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2OMerck & Co., Inc.S9638-25GUsed to prepare TSB media.
PBS-S BufferSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.E607008-0001Basic buffer for living tissues.
PhenylalanineRYONRT3486L005Used to prepare MSgg media.
PipetteBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.BS-1000-TUsed for strain inoculation.
PMD19T PlasmidTakara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.D102AUsed to generate qPCR standard curves.
PotSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.YHHWS2401Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCRSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR InstrumentThermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.4484073Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
RoaryThe Wellcome Trust SangerInstituteN/AUsed to design primers of qPCR
ShakerShanghai Zhichu Instrument Co.,LtdZQTY-50SUsed for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.SL77080596Used to prepare TSB media.
Soy peptoneQingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., LtdHB8275Used to prepare TSB media.
SpectrophotometerShanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.76713100010Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile WaterSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.SW150302Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile GlovesBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.223016852LLZAUsed for basic experimental operations.
Template DNASangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
ThiamineBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
TryptoneThermo Fisher ScientificLP0042BUsed to prepare TSB media.
TryptophanBioolook Scientific Research Special2190020Used to prepare MSgg media.
TSB MediumGuangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.024048Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg MeidiumNanjing Agricultural UniversityN/AMixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2Nanjing Chemical Reagent Co.,LtdC0310520123Used to prepare MSgg media.

参考文献

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