Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

Zusammenfassung

Hier wird ein schnelles und standardisiertes Verfahren zur Etablierung synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus verschiedenen Rhizosphärenböden vorgestellt. Es handelt sich um ein einzigartiges Protokoll, das entwickelt wurde, um die komplexe Bodenmikrobiota der Rhizosphäre zu untersuchen und zu simulieren.

Zusammenfassung

Der Multispezies-Biofilm ist eine natürlich vorkommende und dominante Lebensweise von Bakterien in der Natur, auch im Rhizosphärenboden, auch wenn das derzeitige Verständnis dafür begrenzt ist. Hier bieten wir einen Ansatz an, um schnell synergistische Multispezies-Biofilmgemeinschaften zu etablieren. Der erste Schritt besteht darin, Zellen aus dem Rhizosphärenboden mit der Differenzialzentrifugationsmethode zu extrahieren. Anschließend werden diese Bodenzellen in das Kulturmedium inokuliert, um einen Pellikel-Biofilm zu bilden. Nach 36 Stunden Inkubation wird die bakterielle Zusammensetzung des Biofilms und der darunter liegenden Lösung mit der 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsmethode bestimmt. In der Zwischenzeit wird die bakterielle Isolierung mit hohem Durchsatz aus dem Pellikel-Biofilm mit der limitierenden Verdünnungsmethode durchgeführt. Dann werden die Top 5 der bakteriellen Taxa mit der höchsten Abundanz in den 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten (Pellikel-Biofilmproben) für die weitere Verwendung bei der Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften ausgewählt. Alle Kombinationen der 5 bakteriellen Taxa wurden schnell mit einer 24-Well-Platte etabliert, die durch den Kristallviolett-Färbeassay für die stärkste Biofilmbildungsfähigkeit ausgewählt und durch qPCR quantifiziert wurde. Schließlich wurden die robustesten synthetischen bakteriellen Multispezies-Biofilmgemeinschaften mit den oben genannten Methoden erhalten. Diese Methodik bietet eine informative Anleitung für die Durchführung von Forschungen zum Multispezies-Biofilm der Rhizosphäre und die Identifizierung repräsentativer Gemeinschaften für die Untersuchung der Prinzipien, die die Interaktionen zwischen diesen Arten bestimmen.

Einleitung

Biofilme stellen komplizierte mikrobielle Gemeinschaften dar, die entweder an Oberflächen befestigt oder mit Grenzflächen verbunden sind. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mehrheit der Bakterien, die in verschiedenen Umgebungen, wie z. B. natürlichen Lebensräumen, klinischen Umgebungen und industriellen Kontexten, vorkommen, in Biofilmgemeinschaften überdauern¹. Im Boden bildet die Rhizosphäre, die die Wurzeloberfläche und den angrenzenden 2 mm dicken Bereich umfasst, eine ökologische Nische mit erhöhter Nährstoffverfügbarkeit. Spezifische Bakterien haben Strategien entwickelt, um diese Nische zu nutzen, die mikrobielle Proliferation zu fördern und die Bildung von Biofilmgemeinschaften in der Rhizosphäre zu fördern².

Rhizosphären-Mikroben gelten als das "zweite Genom" von Pflanzen³. Pflanzenwachstumsfördernde Mikroorganismen (PGPM) gehen eine mutualistische Symbiose mit Pflanzen ein und bieten so eine signifikante Wachstumsförderung und biologische Schädlingsbekämpfung⁴. Einerseits kann PGPM die Pflanzenwurzeln mit Nährstoffen versorgen, die Nährstoffaufnahme verbessern, Krankheitserreger abwehren und Schadstoffe im Rhizosphärenboden abbauen⁵. Auf der anderen Seite nutzt PGPM das Ausscheiden der Pflanzenwurzeln als Nährstoffquelle für Wachstum und Evolution und beeinflusst so den Rhizosphärenboden und das Wurzelsystem durch ihren eigenen Stoffwechsel. Es ist erwähnenswert, dass die Voraussetzung für all diese Funktionen die effektive Besiedlung von PGPM in der Pflanzenrhizosphäre ist, die stabile Biofilme^{bildet 6}.

Der Rhizosphären-Biofilm beeinflusst den Assemblierungsprozess von Rhizosphären-Mikroben, und die zeitlichen und räumlichen Eigenschaften der Rhizosphären-Mikroben-Assemblierung stehen in engem Zusammenhang mit der Interaktion von Multispezies-Biofilmen⁷. Es dient als Drehscheibe für Pflanzen-Mikrobiom-Interaktionen und bietet eine stabile und kontrollierbare Nische, in der sie effektiv interagieren können. Daher ist die Untersuchung des Rhizosphären-Biofilms auch eine wichtige Richtung, um Einblicke in die Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben zu gewinnen.

Derzeit gibt es jedoch nur wenige Forschungen zu Multispezies-Biofilmen in der Rhizosphäre. Die hohe Komplexität der Zusammensetzung des Mikrobioms macht es schwierig, grundlegende ökologische Fragen rund um natürliche mikrobielle Gemeinschaften zu beantworten⁸. Bei den Experimenten müssen viele Bedingungen, wie z. B. die Bodenart, die Pflanzenart und die große Anzahl mikrobieller Gemeinschaften, berücksichtigt werden. Verschiedene Faktoren schränken die Erforschung von Rhizosphären-Multispezies-Biofilmen ein.

Um Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden weiter zu untersuchen, wie z.B. synergistische Wechselwirkungen zwischen den Spezies oder Metaboliten-Crossfeeding⁸, ist es wünschenswert, eine vereinfachte, repräsentative, stabile und handhabbare synthetische mikrobielle Gemeinschaft unter Laborbedingungen künstlich zu konstruieren ^9,10. Hier kombiniert ein standardisiertes Protokoll mehrere der neuesten mikrobiologischen und bioinformatischen Techniken.

Protokoll

Dieses Protokoll ist allgemein auf die Bodenmikrobiota der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen anwendbar. Hier wird die Gurke als Beispiel verwendet. Einzelheiten zu den für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von Bakterien

1. Isolierung des Rhizosphärenbodens
   1. Gurkenkultur
      1. Die Gurkensamen werden mit 75 % Ethanol und 2 % Natriumhypochlorit (NaClO) desinfiziert und anschließend in sterilem Wasser abgespült¹¹.
      2. Lassen Sie die Samen unter sterilen Bedingungen keimen und wählen Sie diejenigen aus, die das zweiblättrige Stadium¹² erreichen. Anschließend pflanzen Sie die gleichmäßig gekeimten Gurkenkeimlinge in Töpfe mit 2 kg Schwarzerde um.
         HINWEIS: Es werden zwei Arten von Schwarzerde von verschiedenen Standorten im Nordosten Chinas verwendet, um systematische Fehler zu reduzieren.
   2. Vorbereitung der Bodensuspension
      1. Bereiten Sie PBS-S-Puffer mit der Formulierung vor: 6,33 g NaH₂PO₄· H₂O, 16,5 g Na₂HPO_{4,7H 2}O, 200 μl Silwet L-77 und 1 l destilliertes Wasser.
      2. Wenn die Sämlinge das vierblättrige Stadium¹² erreicht haben, drehen Sie den Topf um und isolieren Sie die Wurzeln zusammen mit 2 mm dicker Rhizosphärenerde mit sterilisierten Handschuhen.
      3. Legen Sie die Wurzeln in 30 mL PBS-S-Puffer in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen. Nach 20 min Schütteln filtrieren Sie die Suspension durch einen 100 μm Nylon-Zellfilter, um Wurzeln und große Sedimente zu entfernen.
      4. Das Filtrat wird in ein weiteres 50 mL Zentrifugenröhrchen umgefüllt, bei 3200 x g für 15 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und bei 4 °C zwischengelagert.
2. Extraktion von Bakterienzellen des Rhizosphärenbodens.
   ANMERKUNG: Dieses Verfahren verwendet das differentielle Zentrifugationsverfahren¹³, obwohl das Nycodenz-Dichtegradientenzentrifugationsverfahren¹⁴ auch für diesen Schritt gilt.
   1. Die Bodensuspension mit einer 0,2%igen Na₄P₂O_7-Lösung auf 500 mL verdünnen und 10 min bei 1.000 x g zentrifugieren, um zunächst Organismen vom Boden zu trennen.
   2. Den Niederschlag erneut homogenisieren, 60 s lang bei der gleichen niedrigen Geschwindigkeit zentrifugieren und den Vorgang dreimal wiederholen. Kombinieren Sie die Überstände, zentrifugieren Sie sie 20 Minuten lang bei 12.000 x g und entsorgen Sie dann den Überstand.
   3. Resuspendieren Sie das Präzipitat in 50 mL PBS-S-Puffer, der die bakterielle Zellsuspension des Rhizosphärenbodens bildet.

2. Sequenzierung und Identifizierung der Mikrobiota des Rhizosphären-Biofilms

1. Vorbereitung der Medien
   HINWEIS: Tryptische Sojabrühe (TSB) und Glyceringlutamat (MSgg) mit minimalen Salzen sind im Handel erhältlich. Die folgenden Formulierungen dienen nur als Referenz.
   1. Bereiten Sie das TSB-Medium mit der folgenden Formulierung vor: 15 μg/mL Trypton, 5 μg/mL Sojapepton, 5 μg/mL NaCl, pH = 7.
   2. Bereiten Sie das MSgg-Medium mit der folgenden Formulierung vor: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM 3-(N-morpholino) Propansulfonsäure (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM Thiamin, 0,5 % Glycerin, 0,5 % Glutamat, 50 μg/ml Tryptophan, 50 μg/ml Phenylalanin, pH-Wert = 7.
   3. Um TSB-MSgg-Medien vorzubereiten, mischen Sie TSB-Medien mit MSgg-Medien im Verhältnis 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Pellicle-Biofilm-Kokultur
   1. Inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht (in der Regel 12 h) in TSB-Medium bei 30 °C, um die Bakterien zu aktivieren.
   2. Platzieren Sie 100 μm Nylon-Zellfilter auf 24-Well-Platten. Inkubieren Sie die Bakterien in TSB-Medien und richten Sie drei Wiederholungen ein. Kultivieren Sie den Pellikel-Biofilm 36 h lang bei 30 °C.
      HINWEIS: Wenn der Pellikel-Biofilm aus dem letzten Schritt nicht gut kultiviert ist, ist das TSB-MSgg-Medium ein wirksamer Ersatz für das TSB-Medium.
   3. Entfernen Sie den Filter, der den Pellikel-Biofilm enthält. Geben Sie 2 ml PBS-S-Puffer in eine neue 24-Well-Zellplatte, setzen Sie den 24-Well-Filter ein, um den Biofilm zu waschen, und entfernen Sie die freien Zellen. Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal.
3. Extraktion der DNA des Pellikel-Biofilms
   1. Extrahieren Sie das Biofilm-Genom mit einem DNA-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Hochdurchsatz-Sequenzierung
   HINWEIS: Biotech-Unternehmen können bei der Durchführung von Sequenzierungsexperimenten für die meisten Labore helfen. Wenn eine mikrobielle Zusammensetzung in der verbleibenden Lösung benötigt wird, sequenzieren Sie sie in diesem Schritt. Der Sequenzierungsschritt variiert je nach Instrument. Bitte beachten Sie die Angaben des Herstellers. Schritt 2.4.1 dient nur als Referenz.
   1. Amplifizieren Sie die V3-V4-Regionen des 16S rRNA-Gens basierend auf der Datenbank mit 16S rRNA-Gensequenzen in voller Länge. Erstellen Sie Spezies-OTUs entsprechend der Mindestanzahl von Sequenzen pro Probe¹⁶. Gruppieren Sie die Annotationen zur Artenklassifizierung und ermitteln Sie die Zusammensetzung der Gemeinschaften aus jeder Stichprobe.
   2. Wählen Sie auf der Grundlage der Sequenzierungsdaten die fünf wichtigsten Stämme in Bezug auf ihre relative Häufigkeit aus.
5. Isolierung und Kultur von Bakterien mit hohem Durchsatz
   HINWEIS: Dieser Schritt ist nach der neuesten mikrobiologischen und bioinformatischen Methodik¹⁷ konzipiert. Für die bakterielle Isolierung steht hier das verdünnungsbeschichtete Plattenverfahren zur Verfügung, das allerdings im Vergleich zu Hochdurchsatztechniken zeitaufwändiger und weniger zielgerichtet ist.
   1. Mischen Sie den kultivierten Biofilm. Verwenden Sie eine begrenzende Verdünnung, um sicherzustellen, dass nicht mehr als 30 % der Vertiefungen in der 24-Well-Platte Bakterienwachstum aufweisen.
      HINWEIS: Um die am besten geeignete Verdünnung zu bestimmen, führen Sie vorläufige Versuche mit einem breiten Spektrum von Verdünnungsraten durch. Die optimale Verdünnung sollte nicht mehr als zwei kultivierbare Bakterien pro Milliliter enthalten, was einer bakteriellen Inkubation in weniger als 30 % der Vertiefungen entspricht.
   2. Amplifizieren Sie das 16S rRNA-Gen der Bakterien, fügen Sie Markierungen für die Vertiefungen und Platten hinzu und sequenzieren Sie sie mit der Hochdurchsatz-Illumina-Plattform¹⁷.
   3. Führen Sie bioinformatische Analysen mit kommerziell erhältlicher Software durch, um Informationen zur Reinheit und zum Artentaxonom für jede Kultur zu erhalten.
   4. Kultivieren Sie die fünf am häufigsten vorkommenden reinen Bakterien durch kontinuierliche Linienkultur und verwenden Sie Glycerin, um die Bakterien bei -80 °C zu konservieren.

3. Aufbau synthetischer mikrobieller Gemeinschaften

1. Rekonstruierte Biofilmkultur
   HINWEIS: Für Details verweisen wir auf Ren et ^al.18. Die 5 Stämme entsprechen 31 synthetischen Kombinationen, darunter 5 Einzelarten-, 10 Zweiarten-, 10 Dreiarten-, 5 Vierarten- und 1 Fünf-Spezies-Konsortien.
   1. Inkubiere die 5 Stämme im TSB-Medium, bis ihr OD₆₀₀ 1 erreicht, um sie zu aktivieren.
   2. Bereiten Sie mehrere 24-Well-Platten mit TSB-Medium vor und platzieren Sie 100 μm Nylon-Zellfilter darauf.
      HINWEIS: Wenn der Biofilm aus dem letzten Schritt nicht gut kultiviert ist, ist das TSB-MSgg-Medium ein wirksamer Ersatz für das TSB-Medium.
   3. Inkubieren Sie die 31 Kombinationen synthetischer Gemeinschaften im Medium. Stellen Sie sicher, dass die Anzahl der Bakterien in jeder Vertiefung konstant ist. Richten Sie für jede Kombination drei Wiederholungen ein.
   4. Kultivieren Sie den Biofilm bei 30 °C für 36 h.
2. Quantifizierung des Pellikel-Biofilms
   1. Gehen Sie genauso vor wie in Schritt 2.2.3.
   2. Übertragen Sie den Biofilm auf eine neue 24-Well-Platte mit 180 μl kristallvioletter Lösung und färben Sie ihn 20 Minuten lang.
   3. Übertragen Sie die gefärbte Probe auf eine weitere 24-Well-Platte mit 200 μl 96 % Ethanol, eluieren Sie sie 30 Minuten lang und messen Sie OD₅₉₀.

4. Quantifizierung der Zellzahl der Pellicle

HINWEIS: Um den Anteil jeder Spezies und die Zellzahlen in der Pellikel und der verbleibenden Lösung zu bestimmen, ist eine quantitative PCR erforderlich. Für Details siehe Sun et ^al.16.

1. Entwicklung stammspezifischer Primer für die ausgewählten synthetischen mikrobiellen Gemeinschaften.
2. Verwenden Sie Roary, um Genomvergleiche durchzuführen und die stammspezifischen Einzelkopie-Gene jedes Isolats herauszufinden. Stellen Sie sicher, dass die Primer auf diese Gene ausgerichtet sind.
3. Ligasieren Sie die amplifizierten Fragmente zu PMD19T-Plasmiden. Generieren Sie Standardkurven mit den Plasmiden, die entsprechende Fragmente als Vorlagen enthalten.
4. Befolgen Sie die gleichen Schritte wie in Schritt 2.2 beschrieben.
5. Bereiten Sie die Reaktionskomponenten wie folgt vor: 7,2 μl H₂O, 10 μl 2x qPCR Master Mix, 0,4 μl 10 μM jedes Primers und 2 μl Template-DNA.
6. Führen Sie die PCR mit einem Echtzeit-PCR-Gerät unter den folgenden Bedingungen durch: 95 °C für 10 Minuten, 40 Zyklen von 95 °C für 30 s und 60 °C für 45 s, gefolgt von einem Standard-Schmelzkurvensegment.
7. Führen Sie für jede Behandlung sechs biologische Replikate durch.

Ergebnisse

Nach dem genannten Verfahren werden signifikante Gradienten in der Biofilmbildungskapazität der Gurken-Rhizosphären-Bodenmikrobiota beobachtet (Abbildung 1). Die Sequenzierung von Biofilm-Amplikonen bestätigte die Spezies im Pellikel (Abbildung 2). Basierend auf dem Heatmapping der Sequenzierungsdaten wurden die fünf wichtigsten Bakterienarten ausgewählt, deren Häufigkeit im Pellikel größer ist als die in der verbleibenden Lösung (A...

Diskussion

Gemäß dem Protokoll wird eine Reihe robuster synthetischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aufgebaut, die auf der Mikrobiota im Rhizosphärenboden verschiedener Pflanzen basieren. Mit quantitativen PCR-Techniken wird die Zusammensetzung jeder Gemeinschaft eindeutig entschlüsselt. Die Biomasse des Biofilms deutet auf die Stärke ihrer potentiellen metabolischen Wechselwirkungen hin, wenngleich verschiedene Eigenschaften und Mechanismen hinter der Kooperation hier nicht aufgeklärt werden konnten^19<...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.