Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

Zusammenfassung

Hier wird ein schnelles und standardisiertes Verfahren zur Etablierung synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus verschiedenen Rhizosphärenböden vorgestellt. Es handelt sich um ein einzigartiges Protokoll, das entwickelt wurde, um die komplexe Bodenmikrobiota der Rhizosphäre zu untersuchen und zu simulieren.

Zusammenfassung

Der Multispezies-Biofilm ist eine natürlich vorkommende und dominante Lebensweise von Bakterien in der Natur, auch im Rhizosphärenboden, auch wenn das derzeitige Verständnis dafür begrenzt ist. Hier bieten wir einen Ansatz an, um schnell synergistische Multispezies-Biofilmgemeinschaften zu etablieren. Der erste Schritt besteht darin, Zellen aus dem Rhizosphärenboden mit der Differenzialzentrifugationsmethode zu extrahieren. Anschließend werden diese Bodenzellen in das Kulturmedium inokuliert, um einen Pellikel-Biofilm zu bilden. Nach 36 Stunden Inkubation wird die bakterielle Zusammensetzung des Biofilms und der darunter liegenden Lösung mit der 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsmethode bestimmt. In der Zwischenzeit wird die bakterielle Isolierung mit hohem Durchsatz aus dem Pellikel-Biofilm mit der limitierenden Verdünnungsmethode durchgeführt. Dann werden die Top 5 der bakteriellen Taxa mit der höchsten Abundanz in den 16S rRNA-Gen-Amplikon-Sequenzierungsdaten (Pellikel-Biofilmproben) für die weitere Verwendung bei der Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften ausgewählt. Alle Kombinationen der 5 bakteriellen Taxa wurden schnell mit einer 24-Well-Platte etabliert, die durch den Kristallviolett-Färbeassay für die stärkste Biofilmbildungsfähigkeit ausgewählt und durch qPCR quantifiziert wurde. Schließlich wurden die robustesten synthetischen bakteriellen Multispezies-Biofilmgemeinschaften mit den oben genannten Methoden erhalten. Diese Methodik bietet eine informative Anleitung für die Durchführung von Forschungen zum Multispezies-Biofilm der Rhizosphäre und die Identifizierung repräsentativer Gemeinschaften für die Untersuchung der Prinzipien, die die Interaktionen zwischen diesen Arten bestimmen.

Einleitung

Biofilme stellen komplizierte mikrobielle Gemeinschaften dar, die entweder an Oberflächen befestigt oder mit Grenzflächen verbunden sind. Es ist allgemein anerkannt, dass die Mehrheit der Bakterien, die in verschiedenen Umgebungen, wie z. B. natürlichen Lebensräumen, klinischen Umgebungen und industriellen Kontexten, vorkommen, in Biofilmgemeinschaften überdauern¹. Im Boden bildet die Rhizosphäre, die die Wurzeloberfläche und den angrenzenden 2 mm dicken Bereich umfasst, eine ökologische Nische mit erhöhter Nährstoffverfügbarkeit. Spezifische Bakterien haben Strategien entwickelt, um diese Nische zu nutzen, die mikrobielle Proliferation zu förd....

Protokoll

Dieses Protokoll ist allgemein auf die Bodenmikrobiota der Rhizosphäre verschiedener Pflanzen anwendbar. Hier wird die Gurke als Beispiel verwendet. Einzelheiten zu den für die Studie verwendeten Reagenzien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung von Bakterien

1. Isolierung des Rhizosphärenbodens
   1. Gurkenkultur
      1. Die Gurkensamen werden mit 75 % Ethanol und 2 % Natriumhypochlorit (NaClO) desinfiziert und anschließend in sterilem Wasser abgespült¹¹.
      2. Lassen Sie die Samen unter sterilen Bedingungen keimen und wählen Sie diejenigen au....

Diskussion

Gemäß dem Protokoll wird eine Reihe robuster synthetischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aufgebaut, die auf der Mikrobiota im Rhizosphärenboden verschiedener Pflanzen basieren. Mit quantitativen PCR-Techniken wird die Zusammensetzung jeder Gemeinschaft eindeutig entschlüsselt. Die Biomasse des Biofilms deutet auf die Stärke ihrer potentiellen metabolischen Wechselwirkungen hin, wenngleich verschiedene Eigenschaften und Mechanismen hinter der Kooperation hier nicht aufgeklärt werden konnten^19<.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.