Une approche pour la construction de communautés de biofilms multispécifiques à partir du sol de la rhizosphère

Résumé

Une procédure rapide et standardisée pour établir des communautés de biofilms multi-espèces synergiques à partir de divers sols de la rhizosphère est présentée ici. Il s’agit d’un protocole unique conçu pour sonder et simuler le microbiote complexe du sol de la rhizosphère.

Résumé

Le biofilm multi-espèces est un mode de vie naturel et dominant des bactéries dans la nature, y compris dans le sol de la rhizosphère, bien que la compréhension actuelle soit limitée. Ici, nous proposons une approche pour établir rapidement des communautés synergiques de biofilms multi-espèces. La première étape consiste à extraire des cellules du sol de la rhizosphère en utilisant la méthode de centrifugation différentielle. Ensuite, ces cellules du sol sont inoculées dans le milieu de culture pour former un biofilm pelliculaire. Après 36 h d’incubation, la composition bactérienne du biofilm et de la solution sous-jacente est déterminée à l’aide de la méthode de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S. Pendant ce temps, l’isolement bactérien à haut débit du biofilm pellicle est effectué à l’aide de la méthode de dilution limitante. Ensuite, les 5 premiers taxons bactériens sont sélectionnés avec la plus grande abondance dans les données de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S (échantillons de biofilm de pellicule) pour une utilisation ultérieure dans la construction de communautés de biofilms multi-espèces. Toutes les combinaisons des 5 taxons bactériens ont été rapidement établies à l’aide d’une plaque de 24 puits, sélectionnée pour la plus forte capacité de formation de biofilm par le test de coloration au violet cristallin, et quantifiée par qPCR. Enfin, les communautés de biofilms multi-espèces bactériennes synthétiques les plus robustes ont été obtenues par les méthodes ci-dessus. Cette méthodologie fournit des orientations informatives pour mener des recherches sur le biofilm multi-espèces de la rhizosphère et identifier des communautés représentatives pour étudier les principes régissant les interactions entre ces espèces.

Introduction

Les biofilms représentent des communautés microbiennes complexes, soit fixées à des surfaces, soit reliées par des interfaces. Il est largement reconnu que la majorité des bactéries rencontrées dans divers environnements, tels que les habitats naturels, les milieux cliniques et les contextes industriels, perdurent au sein des communautés de biofilms¹. Dans le sol, la rhizosphère, qui englobe la surface racinaire et la région adjacente de 2 mm d’épaisseur, forme une niche écologique avec une disponibilité accrue des nutriments. Des bactéries spécifiques ont développé des stratégies pour exploiter ce créneau, favorisant la prolifération microbien....

Protocole

Ce protocole est généralement applicable au microbiote du sol de la rhizosphère de diverses plantes. Ici, le concombre est utilisé comme exemple. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement bactérien

1. Isolement du sol de la rhizosphère
   1. Culture du concombre
      1. Désinfectez les graines de concombre avec une solution d’éthanol à 75 % et d’hypochlorite de sodium à 2 % (NaClO), puis rincez-les à l’eau stérile¹¹.
      2. Faites germer les graines dans des conditions stériles et sélectionnez....

Discussion

Conformément au protocole, une série de communautés de biofilms synthétiques multi-espèces robustes sont construites sur la base du microbiote dans le sol de la rhizosphère à partir de différentes plantes. À l’aide de techniques de PCR quantitative, la composition de chaque communauté est clairement déchiffrée. La biomasse du biofilm indique la force de leurs interactions métaboliques potentielles, bien que diverses propriétés et mécanismes à l’origine de la coopération n’aient pas pu être révé.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.