Une approche pour la construction de communautés de biofilms multispécifiques à partir du sol de la rhizosphère

Résumé

Une procédure rapide et standardisée pour établir des communautés de biofilms multi-espèces synergiques à partir de divers sols de la rhizosphère est présentée ici. Il s’agit d’un protocole unique conçu pour sonder et simuler le microbiote complexe du sol de la rhizosphère.

Résumé

Le biofilm multi-espèces est un mode de vie naturel et dominant des bactéries dans la nature, y compris dans le sol de la rhizosphère, bien que la compréhension actuelle soit limitée. Ici, nous proposons une approche pour établir rapidement des communautés synergiques de biofilms multi-espèces. La première étape consiste à extraire des cellules du sol de la rhizosphère en utilisant la méthode de centrifugation différentielle. Ensuite, ces cellules du sol sont inoculées dans le milieu de culture pour former un biofilm pelliculaire. Après 36 h d’incubation, la composition bactérienne du biofilm et de la solution sous-jacente est déterminée à l’aide de la méthode de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S. Pendant ce temps, l’isolement bactérien à haut débit du biofilm pellicle est effectué à l’aide de la méthode de dilution limitante. Ensuite, les 5 premiers taxons bactériens sont sélectionnés avec la plus grande abondance dans les données de séquençage de l’amplicon du gène de l’ARNr 16S (échantillons de biofilm de pellicule) pour une utilisation ultérieure dans la construction de communautés de biofilms multi-espèces. Toutes les combinaisons des 5 taxons bactériens ont été rapidement établies à l’aide d’une plaque de 24 puits, sélectionnée pour la plus forte capacité de formation de biofilm par le test de coloration au violet cristallin, et quantifiée par qPCR. Enfin, les communautés de biofilms multi-espèces bactériennes synthétiques les plus robustes ont été obtenues par les méthodes ci-dessus. Cette méthodologie fournit des orientations informatives pour mener des recherches sur le biofilm multi-espèces de la rhizosphère et identifier des communautés représentatives pour étudier les principes régissant les interactions entre ces espèces.

Introduction

Les biofilms représentent des communautés microbiennes complexes, soit fixées à des surfaces, soit reliées par des interfaces. Il est largement reconnu que la majorité des bactéries rencontrées dans divers environnements, tels que les habitats naturels, les milieux cliniques et les contextes industriels, perdurent au sein des communautés de biofilms¹. Dans le sol, la rhizosphère, qui englobe la surface racinaire et la région adjacente de 2 mm d’épaisseur, forme une niche écologique avec une disponibilité accrue des nutriments. Des bactéries spécifiques ont développé des stratégies pour exploiter ce créneau, favorisant la prolifération microbienne et favorisant la formation de communautés de biofilms dans la rhizosphère².

Les microbes de la rhizosphère sont considérés comme le « deuxième génome » des plantes³. Les micro-organismes favorisant la croissance des plantes (PGPM) s’engagent dans une symbiose mutualiste avec les plantes, fournissant des fonctions significatives de promotion de la croissance et de biocontrôle⁴. D’une part, le PGPM peut fournir des nutriments aux racines des plantes, améliorer l’absorption des nutriments, se défendre contre les agents pathogènes et dégrader les polluants dans le sol de la rhizosphère⁵. D’autre part, le PGPM utilise les exsudats racinaires des plantes comme source de nutriments pour la croissance et l’évolution, influençant ainsi le sol de la rhizosphère et le système racinaire par leur propre métabolisme. Il convient de noter que la condition préalable à toutes ces fonctions est la colonisation efficace des PGPM dans la rhizosphère végétale, formant des biofilms stables⁶.

Le biofilm de la rhizosphère affecte le processus d’assemblage des microbes de la rhizosphère, et les caractéristiques temporelles et spatiales de l’assemblage des microbes de la rhizosphère sont étroitement liées à l’interaction du biofilm multi-espèces⁷. Il sert de plaque tournante des interactions plante-microbiome, fournissant une niche stable et contrôlable pour qu’ils interagissent efficacement. Par conséquent, l’étude du biofilm de la rhizosphère est également une direction importante pour mieux comprendre l’interaction entre les plantes et les microbes.

Cependant, il existe actuellement peu de recherches sur les biofilms multi-espèces de la rhizosphère. La grande complexité de la composition du microbiome rend difficile la réponse aux questions écologiques fondamentales entourant les communautés microbiennes naturelles⁸. Au cours des expériences, de nombreuses conditions, telles que le type de sol, le type de plante et le grand nombre de communautés microbiennes, doivent être prises en compte. Divers facteurs limitent la recherche de biofilms multi-espèces de la rhizosphère.

Pour étudier plus en détail les communautés de biofilms multispécifiques du sol de la rhizosphère, telles que les interactions synergiques interespèces ou l’alimentation croisée des métabolites⁸, il est souhaitable de construire artificiellement une communauté microbienne synthétique simplifiée, représentative, stable et traitable dans des conditions de laboratoire ^9,10. Ici, un protocole standardisé combine plusieurs des dernières techniques microbiologiques et bioinformatiques.

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Protocole

Ce protocole est généralement applicable au microbiote du sol de la rhizosphère de diverses plantes. Ici, le concombre est utilisé comme exemple. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Isolement bactérien

1. Isolement du sol de la rhizosphère
   1. Culture du concombre
      1. Désinfectez les graines de concombre avec une solution d’éthanol à 75 % et d’hypochlorite de sodium à 2 % (NaClO), puis rincez-les à l’eau stérile¹¹.
      2. Faites germer les graines dans des conditions stériles et sélectionnez celles qui atteignent le stade¹² à deux feuilles. Par la suite, transplantez les plants de concombre uniformément germés dans des pots contenant 2 kg de terre noire.
         REMARQUE : Deux types de terre noire provenant de différents endroits du nord-est de la Chine sont utilisés pour réduire les erreurs systématiques.
   2. Préparation de la suspension du sol
      1. Préparer le tampon PBS-S à l’aide de la formulation : 6,33 g de NaH₂PO₄· H₂O, 16,5 g de Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL de Silwet L-77 et 1 L d’eau distillée.
      2. Lorsque les semis atteignent le stade¹² à quatre feuilles, retournez le pot et isolez les racines avec un sol rhizosphérique de 2 mm d’épaisseur à l’aide de gants stérilisés.
      3. Placez les racines dans 30 mL de tampon PBS-S dans un tube à centrifuger de 50 mL. Après avoir secoué pendant 20 min, filtrez la suspension à travers un filtre à cellules en nylon de 100 μm pour éliminer les racines et les gros sédiments.
      4. Transférez le filtrat dans un autre tube à centrifuger de 50 ml, centrifugez-le à 3200 x g pendant 15 min à température ambiante et stockez-le temporairement à 4 °C.
2. Extraction de cellules bactériennes du sol de la rhizosphère.
   REMARQUE : Cette méthodologie adopte la méthode de centrifugation différentielle¹³, bien que la méthode de centrifugation à gradient de densité de Nycodenz¹⁴ s’applique également à cette étape.
   1. Diluer la suspension de sol avec une solution de Na₄P₂O₇ à 0,2 % à 500 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 10 min pour séparer initialement les organismes du sol.
   2. Réhomogénéisez le précipité, centrifugez-le à la même vitesse basse pendant 60 s et répétez le processus trois fois. Mélangez les surnageants, centrifugez-les à 12 000 x g pendant 20 min, puis jetez le surnageant.
   3. Remettre le précipité en suspension dans 50 mL de tampon PBS-S, constituant la suspension de cellules bactériennes du sol de la rhizosphère.

2. Séquençage et identification du microbiobiote de la rhizosphère

1. Préparation des milieux
   REMARQUE : Le bouillon de soja tryptique (TSB) et le milieu de sels minimaux de glycérol glutamate (MSgg) sont disponibles dans le commerce. Les formulations ci-dessous sont fournies à titre indicatif seulement.
   1. Préparer le milieu TSB à l’aide de la formulation suivante : 15 μg/mL de tryptone, 5 μg/mL de peptone de soja, 5 μg/mL de NaCl, pH = 7.
   2. Préparer le milieu MSgg en utilisant la formulation suivante : 5 mM KH₂PO₄, 100 mM d’acide 3-(N-morpholino) propane sulfonique (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM thiamine, 0,5 % de glycérol, 0,5 % de glutamate, 50 μg/mL de tryptophane, 50 μg/mL de phénylalanine, pH = 7.
   3. Pour préparer des supports TSB-MSgg, mélangez des supports TSB avec des supports MSgg dans un rapport de 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Coculture de biofilm pelliculaire
   1. Incuber la suspension cellulaire dans un milieu TSB à 30 °C pendant la nuit (généralement 12 h) pour activer la bactérie.
   2. Placez des filtres cellulaires en nylon de 100 μm sur des plaques à 24 puits. Incuber les bactéries dans un milieu TSB et mettre en place trois répétitions. Cultivez le biofilm pelliculaire pendant 36 h à 30 °C.
      REMARQUE : Si le biofilm pelicule de la dernière étape n’est pas bien cultivé, le milieu TSB-MSgg est un substitut efficace au milieu TSB.
   3. Retirez le filtre contenant le biofilm de la pellicule. Ajoutez 2 ml de tampon PBS-S dans une nouvelle plaque de cellules à 24 puits, placez-y le filtre à 24 puits pour laver le biofilm et retirez les cellules libres. Répétez le processus de lavage trois fois.
3. Extraction de l’ADN du biofilm pellaire
   1. Extrayez le génome du biofilm à l’aide d’un kit d’ADN en suivant les instructions du fabricant.
4. Séquençage à haut débit
   REMARQUE : Les entreprises de biotechnologie peuvent aider à réaliser des expériences de séquençage pour la plupart des laboratoires. Si la composition microbienne de la solution restante est nécessaire, séquencez-la à cette étape. L’étape de séquençage varie en fonction des instruments. Veuillez suivre les instructions du fabricant. L’étape 2.4.1 est fournie à titre indicatif seulement.
   1. Amplifiez les régions V3-V4 du gène de l’ARNr 16S en vous basant sur la base de données avec des séquences complètes du gène de l’ARNr 16S. Créer des UTO d’espèces en fonction du nombre minimum de séquences par échantillon¹⁶. Regroupez les annotations de classification des espèces et acquérez la composition des communautés à partir de chaque échantillon.
   2. D’après les données de séquençage, sélectionnez les cinq principales souches en fonction de leur abondance relative.
5. Isolement et culture bactériennes à haut débit
   REMARQUE : Cette étape est conçue selon les dernières méthodologies microbiologiques et bioinformatiques¹⁷. La méthode de la plaque revêtue de dilution est disponible pour l’isolement bactérien ici, bien qu’elle prenne plus de temps et soit moins ciblée que les techniques à haut débit.
   1. Mélangez le biofilm cultivé. Utilisez une dilution limitative pour vous assurer qu’il n’y a pas plus de 30 % des puits de la plaque à 24 puits qui présentent une croissance bactérienne.
      REMARQUE : Pour déterminer la dilution la plus appropriée, effectuez des expériences préliminaires en utilisant une large gamme de taux de dilution. La dilution optimale ne doit pas contenir plus de deux bactéries cultivables par millilitre, ce qui représente une incubation bactérienne dans moins de 30 % des puits.
   2. Amplifiez le gène de l’ARNr 16S de la bactérie tout en ajoutant des étiquettes pour les puits et les plaques et séquencez-les à l’aide de la plateforme à haut débit Illumina¹⁷.
   3. Effectuer des analyses bioinformatiques à l’aide de logiciels disponibles dans le commerce afin d’obtenir des informations sur la pureté et la taxonomie des espèces pour chaque culture.
   4. Cultivez les cinq bactéries pures les plus abondantes par culture en ligne continue et utilisez du glycérol pour préserver les bactéries à -80 °C.

3. Construction de communautés microbiennes synthétiques

1. Culture de biofilm reconstruite
   REMARQUE : Pour plus de détails, veuillez consulter Ren et ^al.18. Les 5 souches correspondent à 31 combinaisons synthétiques, dont 5 consortiums monospécifiques, 10 consortiums biespèces, 10 consortiums tri-espèces, 5 consortiums quadri-espèces et 1 consortium 5-espèces.
   1. Incuber les 5 souches dans le milieu TSB jusqu’à ce que leur OD₆₀₀ atteigne 1 pour les activer.
   2. Préparez plusieurs plaques de 24 puits avec du milieu TSB et placez-y des filtres à cellules en nylon de 100 μm.
      REMARQUE : Si le biofilm de la dernière étape n’est pas bien cultivé, le milieu TSB-MSgg est un substitut efficace au milieu TSB.
   3. Incuber les 31 combinaisons de communautés synthétiques dans le média. Assurez-vous que le nombre de bactéries inoculées est constant dans chaque puits. Établissez trois répétitions pour chaque combinaison.
   4. Cultivez le biofilm à 30 °C pendant 36 h.
2. Quantification du biofilm pelliculaire
   1. Suivez la même procédure qu’à l’étape 2.2.3.
   2. Transférez le biofilm dans une nouvelle plaque à 24 puits contenant 180 μL de solution de violet cristallin et colorez-le pendant 20 min.
   3. Transférez l’échantillon coloré dans une autre plaque à 24 puits contenant 200 μL d’éthanol à 96 %, éluez-le pendant 30 min et mesurez la DO₅₉₀.

4. Quantification du nombre de cellules pelliculaires

REMARQUE : Pour déterminer la proportion de chaque espèce et le nombre de cellules dans la pellicule et la solution restante, une PCR quantitative est nécessaire. Pour plus de détails, voir Sun et ^al.16.

1. Concevez des amorces spécifiques à la souche pour les communautés microbiennes synthétiques sélectionnées.
2. Utilisez Roary pour effectuer des comparaisons de génome et découvrir les gènes à copie unique spécifiques à la souche de chaque isolat. Assurez-vous que les amorces ciblent ces gènes.
3. Ligase les fragments amplifiés en plasmides PMD19T. Générez des courbes standard à l’aide des plasmides contenant les fragments correspondants comme modèles.
4. Suivez les mêmes étapes que celles mentionnées à l’étape 2.2.
5. Préparez les composants réactionnels comme suit : 7,2 μL de H₂O, 10 μL de 2 mélanges maîtres qPCR, 0,4 μL de 10 μM de chaque amorce et 2 μL d’ADN matrice.
6. Effectuez la PCR à l’aide d’un instrument de PCR en temps réel dans les conditions suivantes : 95 °C pendant 10 min, 40 cycles de 95 °C pendant 30 s et 60 °C pendant 45 s, suivis d’un segment de courbe de fusion standard.
7. Effectuez six répétitions biologiques pour chaque traitement.

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Résultats

Suite à la procédure mentionnée, des gradients significatifs de la capacité de formation de biofilms à partir du microbiote du sol de la rhizosphère du concombre sont observés (Figure 1). Le séquençage de l’amplicon du biofilm a confirmé la présence de l’espèce dans la pellicule (Figure 2). D’après la cartographie thermique des données de séquençage, les cinq principales espèces bactériennes dont l’abondance dans la pellicule est supér...

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Discussion

Conformément au protocole, une série de communautés de biofilms synthétiques multi-espèces robustes sont construites sur la base du microbiote dans le sol de la rhizosphère à partir de différentes plantes. À l’aide de techniques de PCR quantitative, la composition de chaque communauté est clairement déchiffrée. La biomasse du biofilm indique la force de leurs interactions métaboliques potentielles, bien que diverses propriétés et mécanismes à l’origine de la coopération n’aient pas pu être révé...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.