Подход к построению многовидовых биопленочных сообществ из ризосферной почвы

Резюме

Здесь представлена быстрая и стандартизированная процедура создания синергетических многовидовых биопленочных сообществ из различных ризосферных почв. Это уникальный протокол, предназначенный для исследования и моделирования сложной ризосферной почвенной микробиоты.

Аннотация

Многовидовая биопленка является естественным и доминирующим образом жизни бактерий в природе, в том числе в ризосферной почве, хотя в настоящее время ее понимание ограничено. Здесь мы предлагаем подход к быстрому созданию синергетических многовидовых биопленочных сообществ. Первым шагом является извлечение клеток из ризосферного грунта методом дифференциального центрифугирования. После этого эти клетки почвы инокулируются в культуральную среду с образованием биопленки пленки. После 36 ч инкубации бактериальный состав биопленки и находящегося под ней раствора определяют с помощью метода секвенирования ампликонов гена 16S рРНК. Между тем, высокопроизводительное выделение бактерий из биопленки пленки проводится методом предельного разведения. Затем отбираются 5 ведущих бактериальных таксонов с наибольшей численностью в данных секвенирования ампликонов гена 16S рРНК (образцы биопленки пелликулы) для дальнейшего использования при построении многовидовых биопленочных сообществ. Все комбинации 5 бактериальных таксонов были быстро установлены с помощью 24-луночного планшета, отобраны для наиболее сильной способности к образованию биопленки с помощью анализа окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом и количественно определены с помощью количественной ПЦР. Наконец, наиболее устойчивые синтетические бактериальные многовидовые биопленочные сообщества были получены с помощью описанных выше методов. Данная методология содержит информативные рекомендации по проведению исследований ризосферной многовидовой биопленки и выявлению репрезентативных сообществ для изучения принципов, регулирующих взаимодействие между этими видами.

Введение

Биопленки представляют собой сложные микробные сообщества, прикрепленные к поверхностям или связанные с ними интерфейсами. Широко признано, что большинство бактерий, встречающихся в различных средах, таких как естественная среда обитания, клинические условия и промышленные контексты, сохраняются^{в биопленочных} сообществах. В почве ризосфера, охватывающая поверхность корня и прилегающую к нему область толщиной 2 мм, образует экологическую нишу с повышенной доступностью питательных веществ. Специфические бактерии разработали стратегии для использования этой ниши, способствуя размножению микробов и формированию биопленочных сообществ в^{ризосфере.}

Ризосферные микробы считаются «вторым геномом» растений³. Микроорганизмы, стимулирующие рост растений (ПГПМ), вступают в мутуалистический симбиоз с растениями, обеспечивая значительное стимулирование роста и функции биоконтроля⁴. С одной стороны, PGPM может снабжать корни растений питательными веществами, улучшать усвоение питательных веществ, защищать от патогенов и разлагать загрязняющие вещества в почве ризосферы⁵. С другой стороны, PGPM использует экссудаты корней растений в качестве источника питательных веществ для роста и эволюции, тем самым влияя на ризосферу, почву и корневую систему через их собственный метаболизм. Стоит отметить, что предпосылкой для выполнения всех этих функций является эффективная колонизация ПГПМ в ризосфере растений, образование устойчивых биопленок⁶.

Ризосферная биопленка влияет на процесс сборки ризосферных микробов, а временные и пространственные характеристики сборки ризосферных микробов тесно связаны с взаимодействием многовидовой биопленки⁷. Он служит центром взаимодействия растений и микробиома, обеспечивая стабильную и контролируемую нишу для их эффективного взаимодействия. Поэтому изучение биопленки ризосферы также является важным направлением для получения представления о взаимодействии между растениями и микробами.

Тем не менее, в настоящее время существует мало исследований многовидовых биопленок ризосферы. Высокая сложность состава микробиома затрудняет ответ на фундаментальные экологические вопросы, связанные с природными микробными сообществами⁸. В процессе экспериментов необходимо учитывать множество условий, таких как тип почвы, тип растения и большое количество микробных сообществ. Различные факторы ограничивают исследования ризосферных многовидовых биопленок.

Для дальнейшего изучения многовидовых биопленочных сообществ из ризосферной почвы, таких как межвидовые синергетические взаимодействия или перекрестное питание метаболитов⁸, желательно искусственно создать упрощенное, репрезентативное, стабильное и податливое синтетическое микробное сообщество в лабораторных условиях ^9,10. Здесь стандартизированный протокол сочетает в себе несколько новейших микробиологических и биоинформационных методов.

протокол

Этот протокол в целом применим к ризосферной микробиоте почвы различных растений. Здесь в качестве примера используется огурец. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Бактериальная изоляция

1. Изоляция ризосферных почв
   1. Огуречная культура
      1. Семена огурцов обеззаразить 75% этанолом и 2% раствором гипохлорита натрия (NaClO), затем промыть их в стерильной воде¹¹.
      2. Проращиваем семена в стерильных условиях и отбираем те, которые достигают^12-й стадии двухлистности. Впоследствии пересадите последовательно проросшую рассаду огурцов в горшки, содержащие 2 кг чернозема.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения систематических ошибок используются два типа чернозема из разных мест на северо-востоке Китая.
   2. Подготовка почвенной суспензии
      1. Приготовьте буфер PBS-S по рецептуре: 6,33 г₂PO₄· H₂O, 16,5 г Na₂HPO₄·7H₂O, 200 мкл Silwet L-77 и 1 л дистиллированной воды.
      2. Когда рассада достигнет^12-й стадии четырехлистности, переверните горшок и изолируйте корни вместе с ризосферной почвой толщиной 2 мм, используя стерилизованные перчатки.
      3. Поместите корни в 30 мл буфера PBS-S в центрифужную пробирку объемом 50 мл. После встряхивания в течение 20 минут отфильтруйте суспензию через фильтр с нейлоновыми ячейками 100 мкм, чтобы удалить корни и крупные отложения.
      4. Переложите фильтрат в другую центрифужную пробирку объемом 50 мл, центрифугируйте его при 3200 x g в течение 15 минут при комнатной температуре и временно храните при температуре 4 °C.
2. Экстракция ризосферных почвенных бактериальных клеток.
   Примечание: В данной методике используется метод дифференциального центрифугирования¹³, хотя для этой стадии также применим метод центрифугирования¹⁴ с градиентом плотности по Никоденцу.
   1. Разбавить почвенную суспензию 0,2% раствором Na₄P₂O₇ до 500 мл и центрифугировать при 1000 x g в течение 10 мин для первоначального отделения организмов от почвы.
   2. Повторно гомогенизируйте осадок, центрифугируйте его на той же низкой скорости в течение 60 с и повторите процесс три раза. Соедините надосадочную жидкость, центрифугируйте ее при давлении 12 000 x g в течение 20 минут, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
   3. Ресуспендируйте осадок в 50 мл буфера PBS-S, составляющего суспензию бактериальных клеток ризосферы почвы.

2. Секвенирование и идентификация ризосферной биопленочной микробиоты

1. Подготовка СМИ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Триптический соевый бульон (TSB) и среды с минимальным содержанием солей глицерина глутамата (MSgg) коммерчески доступны. Приведенные ниже формулировки приведены только для справки.
   1. Приготовьте среду TSB с использованием следующей состава: триптон 15 мкг/мл, пептон сои 5 мкг/мл, NaCl 5 мкг/мл, рН = 7.
   2. Готовят среду MSgg с использованием следующей рецептуры: 5 мМ KH₂PO₄, 100 мМ 3-(N-морфолино) пропансульфоновой кислоты (MOPS), 2 мМ MgCl₂, 700 мкМ CaCl₂, 50 мкМ MnCl₂, 50 мкМ FeCl₃, 1 мкМ ZnCl₂, 2 мкМ тиамина, 0,5% глицерина, 0,5% глутамата, 50 мкг/мл триптофана, 50 мкг/мл фенилаланина, рН = 7.
   3. Для приготовления среды TSB-MSgg смешайте среду TSB с средой MSgg в соотношении 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Кокультура биопленки Пелликла
   1. Инкубируйте клеточную суспензию в среде TSB при 30 °C в течение ночи (обычно 12 часов) для активации бактерий.
   2. Поместите фильтры с нейлоновыми ячейками 100 мкм на 24-луночные планшеты. Инкубируйте бактерии в средах TSB и настройте три повторения. Культивируйте биопленку пленки в течение 36 ч при 30 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если биопленка пленки на последнем этапе не была хорошо культивирована, среда TSB-MSgg является эффективной заменой среды TSB.
   3. Снимите фильтр, содержащий биопленку пелликулы. Добавьте 2 мл буфера PBS-S в новую 24-луночную клеточную пластину, поместите в нее 24-луночный фильтр для промывки биопленки и удалите свободные клетки. Повторите процесс стирки три раза.
3. Экстракция ДНК пленки пленки
   1. Извлеките геном биопленки с помощью набора ДНК, следуя инструкциям производителя.
4. Высокопроизводительное секвенирование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Биотехнологические компании могут помочь в проведении экспериментов по секвенированию для большинства лабораторий. Если микробный состав в оставшемся растворе нужен, секвенируйте его на этом этапе. Шаг секвенирования варьируется в зависимости от инструментов. Пожалуйста, следуйте инструкциям производителя. Шаг 2.4.1 приведен только для справки.
   1. Амплифицируйте V3-V4 гена 16S рРНК на основе базы данных с полноразмерными последовательностями гена 16S рРНК. Создание видов OTU в соответствии с минимальным числом последовательностей на выборку¹⁶. Сгруппируйте аннотации классификации видов и получите составы сообществ из каждой выборки.
   2. На основе данных секвенирования выберите пять основных штаммов с точки зрения их относительной численности.
5. Высокопроизводительная бактериальная изоляция и бактериологическое исследование
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап разработан в соответствии с новейшей микробиологической и биоинформатической методологией¹⁷. Для выделения бактерий здесь доступен метод с пластинчатым покрытием с разбавляющим покрытием, хотя он более трудоемкий и менее целенаправленный по сравнению с методами с высокой пропускной способностью.
   1. Перемешайте культивированную биопленку. Используйте предельное разбавление, чтобы гарантировать, что не более 30% лунок в 24-луночном планшете демонстрируют рост бактерий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы определить наиболее подходящее разведение, проведите предварительные эксперименты с использованием широкого диапазона скоростей разведения. Оптимальное разведение должно содержать не более двух культивируемых бактерий на миллилитр, что представляет собой бактериальную инкубацию менее чем в 30% лунок.
   2. Амплифицируйте ген 16S рРНК бактерий, добавляя метки для лунок и планшетов, и секвенируйте их с помощью высокопроизводительной платформы Illumina¹⁷.
   3. Проведение биоинформатического анализа с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для получения таксономической информации о чистоте и видах для каждой культуры.
   4. Культивируйте пять основных распространенных чистых бактерий с помощью непрерывного культивирования и используйте глицерин для сохранения бактерий при температуре -80 °C.

3. Построение синтетических микробных сообществ

1. Реконструированная биопленочная культура
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации, пожалуйста, обратитесь к Ren et ^al.18. 5 штаммов соответствуют 31 синтетической комбинации, включая 5 одновидовых, 10 двухвидовых, 10 трехвидовых, 5 четырехвидовых и 1 пятивидовый консорциум.
   1. Инкубируйте 5 штаммов в среде TSB до тех пор, пока их OD₆₀₀ не достигнет 1, чтобы активировать их.
   2. Подготовьте несколько 24-луночных планшетов со средой TSB и установите на них фильтры с нейлоновыми ячейками 100 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если биопленка с последнего этапа не была хорошо культивирована, среда TSB-MSgg является эффективной заменой среде TSB.
   3. Инкубируйте 31 комбинацию синтетических сообществ в среде. Убедитесь, что количество бактерий в каждой лунке одинаково. Установите по три повторения для каждой комбинации.
   4. Культивируйте биопленку при 30 °C в течение 36 часов.
2. Количественное определение биопленки пелликулы
   1. Выполните ту же процедуру, что и в шаге 2.2.3.
   2. Перенесите биопленку на новый 24-луночный планшет, содержащий 180 мкл кристаллического фиолетового раствора, и окрашивайте его на 20 минут.
   3. Перенесите окрашенный образец в другой 24-луночный планшет, содержащий 200 μл 96% этанола, разбавьте его в течение 30 минут и измерьте внешний диаметр₅₉₀.

4. Количественное определение количества клеток Пелликулы

ПРИМЕЧАНИЕ: Для определения доли каждого вида и количества клеток в пленке и оставшемся растворе необходима количественная ПЦР. Для получения подробной информации см. Sun et ^al.16.

1. Разрабатывайте штаммоспецифичные праймеры для выбранных синтетических микробных сообществ.
2. Используйте Roary для сравнения генома и получения специфичных для штамма генов с одной копией каждого изолята. Убедитесь, что праймеры нацелены на эти гены.
3. Лигазируйте амплифицированные фрагменты до плазмид PMD19T. Создание стандартных кривых с использованием плазмид, содержащих соответствующие фрагменты, в качестве шаблонов.
4. Выполните те же действия, что и в шаге 2.2.
5. Приготовьте реакционные компоненты следующим образом: 7,2 мкл H₂O, 10 мкл 2x кПЦР мастер-смеси, 0,4 мкл 10 мкМ каждого праймера и 2 мкл матричной ДНК.
6. Проводите ПЦР с помощью прибора для ПЦР в реальном времени при следующих условиях: 95 °C в течение 10 мин, 40 циклов при 95 °C в течение 30 с и 60 °C в течение 45 с, после чего следует стандартный сегмент кривой плавления.
7. Выполните шесть биологических повторений для каждой процедуры.

Результаты

После указанной процедуры наблюдаются значительные градиенты биопленкообразующей способности от микробиоты почвы ризосферы огурцов (рис. 1). Секвенирование биопленочных ампликонов подтвердило наличие вида в пленке (Рисунок 2). На основе теплового карт?...

Обсуждение

В соответствии с протоколом на основе микробиоты ризосферной почвы различных растений создается ряд устойчивых синтетических многовидовых биопленочных сообществ. С помощью количественных методов ПЦР четко расшифровывается состав каждого сообщества. Биомасса биопленки указывает н?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.