一种从根际土壤构建多物种生物膜群落的方法

摘要

本文介绍了一种从各种根际土壤建立协同多物种生物膜群落的快速和标准化程序。这是一种独特的协议，旨在探测和模拟复杂的根际土壤微生物群。

摘要

多物种生物膜是自然界中细菌自然存在的主要生活方式，包括根际土壤，尽管目前对它的了解有限。在这里，我们提供了一种快速建立协同多物种生物膜群落的方法。第一步是使用差速离心法从根际土壤中提取细胞。之后，这些土壤细胞接种到培养基中以形成薄膜生物膜。孵育 36 小时后，使用 16S rRNA 基因扩增子测序方法测定生物膜的细菌组成和下面的溶液。同时，使用有限稀释法从表膜生物膜中进行高通量细菌分离。然后，在 16S rRNA 基因扩增子测序数据 （表膜生物膜样本） 中选择丰度最高的前 5 个细菌分类群，以进一步用于构建多物种生物膜群落。使用 24 孔板快速建立 5 个细菌分类群的所有组合，通过结晶紫染色测定选择具有最强生物膜形成能力的生物膜，并通过 qPCR 定量。最后，通过上述方法获得了最强大的合成细菌多物种生物膜群落。该方法为开展根际多物种生物膜研究以及确定代表性群落为研究控制这些物种之间相互作用的原则提供了信息指导。

引言

生物膜代表附着在表面或与界面相连的复杂微生物群落。人们普遍认为，在各种环境（例如自然栖息地、临床环境和工业环境）中遇到的大多数细菌都在生物膜群落中持续存在¹。在土壤中，根际（包括根表面及其相邻的 2 毫米厚区域）形成了一个生态位，养分利用率更高。特定细菌已经进化出利用这一生态位的策略，促进微生物增殖并促进根际生物膜群落的形成²。

根际微生物被认为是植物的“第二个基因组”³。植物生长促进微生物 （PGPM） 与植物共生，提供显着的生长促进和生物控制功能⁴。一方面，PGPM 可以为植物根系提供养分，增强养分吸收，抵御病原体，并降解根际土壤中的污染物⁵。另一方面，PGPM 利用植物根系分泌物作为生长和进化的营养来源，从而通过自身的新陈代谢影响根际土壤和根系。值得注意的是，所有这些功能的先决条件是 PGPM 在植物根际的有效定植，形成稳定的生物膜⁶。

根际生物膜影响根际微生物的组装过程，根际微生物组装的时空特征与多物种生物膜的相互作用密切相关⁷。它是植物与微生物组相互作用的枢纽，为它们提供稳定可控的生态位，以便它们有效互动。因此，研究根际生物膜也是深入了解植物与微生物之间相互作用的重要方向。

然而，目前对根际多物种生物膜的研究很少。微生物组组成的高度复杂性使得回答围绕自然微生物群落的基本生态问题变得具有挑战性⁸。在实验过程中，需要考虑土壤类型、植物类型、微生物群落数量众多等诸多条件。各种因素限制了根际多物种生物膜的研究。

为了进一步研究根际土壤中的多物种生物膜群落，例如种间协同相互作用或代谢物交叉喂养⁸，最好在实验室条件下人工构建一个简化的、有代表性的、稳定的和可处理的合成微生物群落 ^9,10。在这里，标准化方案结合了几种最新的微生物学和生物信息学技术。

研究方案

该协议通常适用于来自各种植物的根际土壤微生物群。这里以 cucumber 为例。材料 表中列出了用于研究的试剂和设备的详细信息。

1. 细菌分离

1. 根际土壤隔离
   1. 黄瓜培养
      1. 用 75% 乙醇和 2% 次氯酸钠 （NaClO） 溶液对黄瓜籽进行消毒，然后用无菌水冲洗¹¹.
      2. 在无菌条件下发芽种子，并选择那些达到双叶阶段¹² 的种子。随后，将持续发芽的黄瓜幼苗移植到装有 2 公斤黑土的花盆中。
         注：采用东北不同产地的两种黑土，以减少系统误差。
   2. 土壤悬浮液制备
      1. 使用以下配方制备 PBS-S 缓冲液：6.33 g NaH₂PO₄·H₂O、16.5 g Na₂HPO₄·7H₂O、200 μL Silwet L-77 和 1 L 蒸馏水。
      2. 当幼苗达到四叶阶段¹² 时，倒置花盆并使用消毒手套将根与 2 毫米厚的根际土壤隔离。
      3. 将根放入 50 mL 离心管中的 30 mL PBS-S 缓冲液中。摇动 20 分钟后，通过 100 μm 尼龙细胞过滤器过滤悬浮液以去除根和大沉淀物。
      4. 将滤液转移到另一个 50 mL 离心管中，在室温下以 3200 x g 离心 15 分钟，然后暂时储存在 4 °C。
2. 根际土壤细菌细胞的提取。
   注：该方法采用差速离心法¹³，尽管 Nycodenz 密度梯度离心法¹⁴ 也适用于此步骤。
   1. 用 0.2% Na₄P₂O₇ 溶液将土壤悬浮液稀释至 500 mL，并以 1,000 x g 离心 10 分钟，以初步将生物体从土壤中分离出来。
   2. 重新匀浆沉淀，以相同的低速离心 60 秒，并重复该过程 3 次。合并上清液，以 12,000 x g 离心 20 分钟，然后弃去上清液。
   3. 将沉淀物重悬于 50 mL 的 PBS-S 缓冲液中，构成根际土壤细菌细胞悬液。

2. 根际生物膜微生物群的测序和鉴定

1. 培养基制备
   注：胰蛋白酶大豆肉汤 （TSB） 和最低盐甘油谷氨酸酯 （MSgg） 培养基可在市场上买到。以下配方仅供参考。
   1. 使用以下配方制备 TSB 培养基：15 μg/mL 胰蛋白胨、5 μg/mL 大豆蛋白胨、5 μg/mL NaCl，pH = 7。
   2. 使用以下配方制备 MSgg 培养基：5 mM KH₂PO₄、100 mM 3-（N-吗啉代）丙烷磺酸 （MOPS）、2 mM MgCl₂、700 μM CaCl₂、50 μM MnCl₂、50 μM FeCl₃、1 μM ZnCl₂、2 μM 硫胺素、0.5% 甘油、0.5% 谷氨酸、50 μg/mL 色氨酸、50 μg/mL 苯丙氨酸、 pH 值 = 7。
   3. 要制备 TSB-MSgg 培养基，请将 TSB 培养基与 MSgg 培养基以 1：1 的比例 （v/v） 混合¹⁵。
2. Pellicle 生物膜共培养
   1. 将细胞悬液在 TSB 培养基中于 30 °C 孵育过夜（通常为 12 小时）以激活细菌。
   2. 将 100 μm 尼龙细胞过滤器放在 24 孔板上。在 TSB 培养基中孵育细菌并设置三次重复。在 30 °C 下培养表膜生物膜 36 小时。
      注意：如果最后一步的表膜生物膜没有得到很好的培养，TSB-MSgg 培养基是 TSB 培养基的有效替代品。
   3. 取下含有薄膜生物膜的过滤器。将 2 mL PBS-S 缓冲液添加到新的 24 孔细胞板中，将 24 孔过滤器放入其中以洗涤生物膜，并去除游离细胞。重复洗涤过程 3 次。
3. 表膜生物膜 DNA 的提取
   1. 按照制造商的说明使用 DNA 试剂盒提取生物膜基因组。
4. 高通量测序
   注意：生物技术公司可以帮助大多数实验室完成测序实验。如果需要剩余溶液中的微生物组成，请在此步骤中对其进行测序。测序步骤因仪器而异。请按照制造商的说明进行操作。步骤 2.4.1 仅供参考。
   1. 基于具有全长 16S rRNA 基因序列的数据库扩增 16S rRNA 基因的 V3-V4 区域。根据每个样品的最小序列数¹⁶ 创建物种 OTU。对物种分类注释进行聚类，并从每个样本中获取群落的组成。
   2. 根据测序数据，根据其相对丰度选择排名前五的菌株。
5. 高通量细菌分离和培养
   注：此步骤是根据最新的微生物学和生物信息学方法¹⁷ 设计的。稀释涂层板方法可用于细菌分离，但与高通量技术相比，它更耗时且针对性更差。
   1. 混合培养的生物膜。使用有限稀释以确保 24 孔板中不超过 30% 的孔显示细菌生长。
      注：要确定最合适的稀释度，请使用各种稀释率进行初步实验。最佳稀释度应每毫升含有不超过两个可培养细菌，代表细菌在不到 30% 的孔中孵育。
   2. 扩增细菌的 16S rRNA 基因，同时为孔和板添加标记，并使用高通量 Illumina 平台¹⁷ 对其进行测序。
   3. 使用市售软件进行生物信息学分析，以获得每种培养物的纯度和物种分类信息。
   4. 通过连续线培养培养前五名丰度纯细菌，并使用甘油在 -80 °C 下保存细菌。

3. 合成微生物群落的构建

1. 重建的生物膜培养物
   注：详情请参考 任 et ^al.18。5 个菌株对应 31 个合成组合，包括 5 个单物种、10 个双物种、10 个三物种、5 个四物种和 1 个五物种联盟。
   1. 在 TSB 培养基中孵育 5 种菌株，直到它们的 OD₆₀₀ 达到 1 以激活它们。
   2. 用 TSB 培养基准备几个 24 孔板，并在其上放置 100 μm 尼龙细胞过滤器。
      注：如果上一步的生物膜没有得到很好的培养，TSB-MSgg 培养基是 TSB 培养基的有效替代品。
   3. 在培养基中孵育合成群落的 31 种组合。确保每个孔中细菌的接种数一致。为每个组合设置 3 次重复。
   4. 在 30 °C 下培养生物膜 36 小时。
2. 表膜生物膜的定量
   1. 按照步骤 2.2.3 中的相同过程进行操作。
   2. 将生物膜转移到含有 180 μL 结晶紫溶液的新 24 孔板中，并染色 20 分钟。
   3. 将染色样品转移到另一个含有 200 μL 96% 乙醇的 24 孔板中，洗脱 30 分钟，并测量 OD₅₉₀。

4. Pellicle 细胞数量定量

注：为了确定每种物种的比例以及表膜和剩余溶液中的细胞计数，有必要进行定量 PCR。有关详细信息，请参阅 Sun et ^al.16。

1. 为选定的合成微生物群落设计菌株特异性引物。
2. 使用 Roary 进行基因组比较并找出每个分离株的菌株特异性单拷贝基因。确保引物靶向这些基因。
3. 将扩增的片段与 PMD19T 质粒连接。使用含有相应片段的质粒作为模板生成标准曲线。
4. 按照步骤 2.2 中提到的相同步骤进行操作。
5. 按如下方式制备反应组分：7.2 μL H₂O、10 μL 2x qPCR Master mix、0.4 μL 10 μM 每种引物和 2 μL 模板 DNA。
6. 在以下条件下使用实时 PCR 仪器进行 PCR：95 °C 10 分钟，95 °C 40 个循环 30 秒，60 °C 45 秒，然后是标准熔解曲线段。
7. 每次处理进行 6 次生物学重复。

结果

按照上述程序，观察到黄瓜根际土壤微生物群的生物膜形成能力的显着梯度（图 1）。生物膜扩增子测序证实了表膜中的物种（图 2）。基于测序数据的热图，选择了表膜中丰度大于剩余溶液中丰度的前五种细菌物种（图 3）。这里以一组典型的合成群落为例。结晶紫染色和定量 PCR 直接可视化表膜生物量的差异和群落中每个物种?...

讨论

按照该方案，基于来自不同植物的根际土壤中的微生物群构建了一系列健壮的合成多物种生物膜群落。使用定量 PCR 技术，可以清楚地破译每个群落的组成。生物膜的生物量表明它们潜在代谢相互作用的强度，尽管这里无法揭示合作背后的各种特性和机制¹⁹。鉴于自然微生物群落的规模和复杂性，合成群落 （SynComs） 代表了克服现有障碍的模型系统¹⁴。该协议强?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.