גישה לבניית קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה

Summary

כאן מוצג הליך מהיר וסטנדרטי להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות מרובות מינים מקרקעות ריזוספרה שונות. זהו פרוטוקול ייחודי שנועד לחקור ולדמות את המיקרוביוטה המורכבת של קרקע ריזוספרה.

Abstract

הביופילם הרב-מיני הוא אורח חיים טבעי ודומיננטי של חיידקים בטבע, כולל באדמת ריזוספרה, אם כי ההבנה הנוכחית שלו מוגבלת. כאן, אנו מספקים גישה להקמת קהילות ביופילם סינרגטיות של מינים מרובים. הצעד הראשון הוא לחלץ תאים מאדמת ריזוספרה בשיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית. לאחר מכן, תאי אדמה אלה מחוסנים לתוך מדיום התרבית כדי ליצור ביופילם כדורי. לאחר 36 שעות של דגירה, הרכב החיידקים של הביופילם והתמיסה שמתחתיו נקבעים באמצעות שיטת ריצוף הגן rRNA 16S. בינתיים, בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה מביופילם כדורי מתבצע בשיטת הדילול המגביל. לאחר מכן, 5 טקסי החיידקים המובילים נבחרים עם השפע הגבוה ביותר בנתוני ריצוף הגן rRNA 16S (דגימות ביופילם pellicle) לשימוש נוסף בבניית קהילות ביופילם מרובות מינים. כל השילובים של 5 טקסי החיידקים נקבעו במהירות באמצעות צלחת בת 24 בארות, שנבחרה עבור יכולת היווצרות הביופילם החזקה ביותר על ידי בדיקת צביעת הקריסטל הסגול, וכומתה על ידי qPCR. לבסוף, קהילות הביופילם הסינתטיות החזקות ביותר של חיידקים מרובי מינים הושגו באמצעות השיטות לעיל. מתודולוגיה זו מספקת הדרכה אינפורמטיבית לביצוע מחקר על ביופילם מרובה מינים של ריזוספרה וזיהוי קהילות מייצגות לחקר העקרונות השולטים באינטראקציות בין מינים אלה.

Introduction

ביופילמים מייצגים קהילות מיקרוביאליות מורכבות המודבקות על משטחים או מקושרות לממשקים. קיימת הכרה רחבה בכך שרוב החיידקים שנתקלים בהם בסביבות שונות, כגון סביבות טבעיות, סביבות קליניות והקשרים תעשייתיים, שורדים בתוך קהילות ביופילם¹. באדמה, הריזוספרה – המקיפה את פני השטח של השורש ואת האזור הסמוך לו בעובי 2 מ"מ – יוצרת נישה אקולוגית עם זמינות מוגברת של חומרי מזון. חיידקים ספציפיים פיתחו אסטרטגיות לניצול נישה זו, טיפוח התרבות מיקרוביאלית וטיפוח היווצרות קהילות ביופילם בריזוספרה².

מיקרובים ריזוספרה נחשבים ל"גנום השני" של צמחים³. מיקרואורגניזמים מעודדי גדילה של צמחים (PGPM) עוסקים בסימביוזה הדדית עם צמחים, ומספקים פונקציות משמעותיות לקידום צמיחה ובקרה ביולוגית⁴. מצד אחד, PGPM יכול לספק חומרים מזינים לשורשי הצמח, לשפר את ספיגת החומרים המזינים, להגן מפני פתוגנים ולפרק מזהמים באדמת הריזוספרה⁵. מצד שני, PGPM משתמש בהפרשה של שורשי צמחים כמקור תזונתי לצמיחה ואבולוציה, ובכך משפיע על אדמת הריזוספרה ועל מערכת השורשים באמצעות חילוף החומרים שלהם. ראוי לציין כי התנאי המוקדם לכל הפונקציות הללו הוא התיישבות יעילה של PGPM בריזוספרה הצמח, יצירת ביופילמים יציבים⁶.

ביופילם ריזוספרה משפיע על תהליך ההרכבה של מיקרובים ריזוספרה, והמאפיינים הרקתיים והמרחביים של הרכבת מיקרובי ריזוספרה קשורים קשר הדוק לאינטראקציה של^{ביופילם} 7 של מינים מרובים. הוא משמש כמרכז של אינטראקציות צמחים-מיקרוביום, ומספק להם נישה יציבה ונשלטת לאינטראקציה יעילה. לכן, חקר ביופילם של ריזוספרה הוא גם כיוון חשוב להשגת תובנה לגבי האינטראקציה בין צמחים למיקרובים.

עם זאת, כיום יש מעט מחקר על ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה. המורכבות הגבוהה של הרכב המיקרוביום מקשה לענות על שאלות אקולוגיות בסיסיות סביב קהילות מיקרוביאליות טבעיות⁸. בתהליך הניסויים יש לקחת בחשבון תנאים רבים, כגון סוג הקרקע, סוג הצמח והמספר הגדול של קהילות מיקרוביות. גורמים שונים מגבילים את המחקר של ביופילמים מרובי מינים של ריזוספרה.

כדי להמשיך ולחקור קהילות ביופילם רב-מינים מאדמת ריזוספרה, כגון אינטראקציות סינרגטיות בין מינים או הזנה צולבת של מטבוליטים⁸, רצוי לבנות באופן מלאכותי קהילה מיקרוביאלית סינתטית פשוטה, מייצגת, יציבה וניתנת להסרה בתנאי מעבדה ^9,10. כאן, פרוטוקול סטנדרטי משלב כמה מהטכניקות המיקרוביולוגיות והביואינפורמטיות העדכניות ביותר.

Protocol

פרוטוקול זה ישים בדרך כלל למיקרוביוטה של קרקע ריזוספרה מצמחים שונים. כאן, מלפפון משמש כדוגמה. פרטים על הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד חיידקים

1. בידוד קרקע ריזוספרה
   1. תרבות מלפפונים
      1. יש לחטא זרעי מלפפון בתמיסת 75% אתנול ונתרן היפוכלוריט 2% (NaClO), ולאחר מכן לשטוף אותם במים סטריליים¹¹.
      2. להנביט את הזרעים בתנאים סטריליים ולבחור את אלה המגיעים לשלב שני העלים¹². לאחר מכן, השתילו את שתילי המלפפון המונבטים באופן עקבי בעציצים המכילים 2 ק"ג אדמה שחורה.
         הערה: שני סוגים של אדמה שחורה ממקומות שונים בצפון מזרח סין משמשים להפחתת טעויות שיטתיות.
   2. הכנת תרחיף קרקע
      1. הכן חיץ PBS-S באמצעות הנוסחה: 6.33 גרם של NaH₂PO₄· H₂O, 16.5 גרם של Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL של סילווט L-77, ו-1 ליטר מים מזוקקים.
      2. כאשר השתילים מגיעים לשלב¹² בעל ארבעת העלים, הופכים את העציץ ומבודדים את השורשים יחד עם אדמת ריזוספירה בעובי 2 מ"מ באמצעות כפפות מעוקרות.
      3. מקם את השורשים בחיץ PBS-S של 30 מ"ל בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל. לאחר ניעור של 20 דקות, סננו את המתלה דרך מסנן תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר כדי להסיר שורשים ומשקעים גדולים.
      4. מעבירים את התסנין לצינור צנטריפוגה נוסף של 50 מ"ל, צנטריפוגות אותו ב 3200 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר, ומאחסנים אותו באופן זמני ב -4 מעלות צלזיוס.
2. מיצוי של תאי חיידקים בקרקע ריזוספרה.
   הערה: מתודולוגיה זו מאמצת את שיטת הצנטריפוגה הדיפרנציאלית¹³, אם כי שיטת הצנטריפוגה ההדרגתית של צפיפות Nycodenz¹⁴ חלה גם על שלב זה.
   1. דללו את תרחיף הקרקע בתמיסת 0.2% Na₄P₂O₇ ל-500 מ"ל וצנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 10 דקות כדי להפריד תחילה אורגניזמים מהקרקע.
   2. הומוגניזציה מחדש של המשקע, צנטריפוגה אותו באותה מהירות נמוכה במשך 60 שניות, ולחזור על התהליך שלוש פעמים. ערבבו את הסופרנאטנטים, צנטריפוגו אותם במהירות של 12,000 x גרם למשך 20 דקות, ואז השליכו את הסופרנאטנט.
   3. להשהות מחדש את המשקע ב 50 מ"ל של חיץ PBS-S, המהווה את השעיית תאי חיידקי הקרקע ריזוספרה.

2. ריצוף וזיהוי מיקרוביוטה של ביופילם ריזוספירה

1. הכנת מדיה
   הערה: מרק סויה טריפטי (TSB) וחומרים עם מינימום מלחים גליצרול גלוטמט (MSgg) זמינים באופן מסחרי. הניסוחים שלהלן הם לעיון בלבד.
   1. הכן TSB בינוני באמצעות הנוסחה הבאה: 15 מיקרוגרם / מ"ל טריפטון, 5 מיקרוגרם / מ"ל פפטון סויה, 5 מיקרוגרם / מ"ל NaCl, pH = 7.
   2. הכן מדיום MSgg באמצעות הניסוח הבא: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM 3-(N-morpholino) פרופאן חומצה סולפונית (MOPS), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM תיאמין, 0.5% גליצרול, 0.5% גלוטמט, 50 מיקרוגרם / מ"ל טריפטופן, 50 מיקרוגרם / מ"ל פנילאלנין, pH = 7.
   3. כדי להכין מדיית TSB-MSgg, ערבב מדיית TSB עם מדיית MSgg ביחס של 1:1 (v/v)¹⁵.
2. קוקולטורה של ביופילם פליקל
   1. לדגור על תרחיף התא בתווך TSB ב 30 ° C במשך הלילה (בדרך כלל 12 שעות) כדי להפעיל את החיידקים.
   2. מניחים מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר על צלחות 24 בארות. לדגור על החיידקים במדיה TSB ולהגדיר שלוש חזרות. לטפח את biofilm pellicle במשך 36 שעות ב 30 ° C.
      הערה: אם הביופילם הכדורי מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.
   3. הסר את המסנן המכיל את הביופילם הכדורי. הוסף 2 מ"ל של חיץ PBS-S לצלחת תא חדשה של 24 בארות, מקם לתוכו את מסנן 24 הבארות כדי לשטוף את הביופילם, והסר את התאים החופשיים. חזרו על תהליך הכביסה שלוש פעמים.
3. מיצוי DNA של ביופילם כדורי
   1. חלץ את גנום הביופילם באמצעות ערכת DNA בהתאם להוראות היצרן.
4. ריצוף בתפוקה גבוהה
   הערה: חברות ביוטכנולוגיה יכולות לסייע בהשלמת ניסויי ריצוף עבור רוב המעבדות. אם יש צורך בהרכב מיקרוביאלי בתמיסה הנותרת, רצף אותו בשלב זה. שלב הרצף משתנה בהתאם למכשירים. פעל בהתאם להוראות היצרן. שלב 2.4.1 מיועד להמחשה בלבד.
   1. להגביר את אזורי V3-V4 של הגן 16S rRNA בהתבסס על מסד הנתונים עם רצפי גנים 16S rRNA באורך מלא. צור OTUs של מינים לפי מספר הרצפים המינימלי לכל מדגם¹⁶. קבץ את ביאורי סיווג המינים ורכוש את הרכבי הקהילות מכל מדגם.
   2. בהתבסס על נתוני הריצוף, בחרו את חמשת הזנים המובילים מבחינת השפע היחסי שלהם.
5. בידוד חיידקים בתפוקה גבוהה ותרבית
   הערה: שלב זה מתוכנן על פי המתודולוגיה המיקרוביולוגית והביואינפורמטית העדכנית ביותר¹⁷. שיטת הצלחת המצופה בדילול זמינה כאן לבידוד חיידקים, אם כי היא גוזלת יותר זמן ופחות ממוקדת בהשוואה לטכניקות בעלות תפוקה גבוהה.
   1. מערבבים את הביופילם המתורבת. השתמשו בדילול מגביל כדי להבטיח שלא יותר מ-30% מהבארות בצלחת בת 24 הקידוחים יראו צמיחת חיידקים.
      הערה: כדי לקבוע את הדילול המתאים ביותר, בצע ניסויים מקדימים באמצעות מגוון רחב של קצבי דילול. הדילול האופטימלי צריך להכיל לא יותר משני חיידקים למיליליטר, המייצגים דגירה חיידקית בפחות מ -30% מהבארות.
   2. הגבירו את גן ה-rRNA 16S של החיידקים תוך הוספת תוויות לבארות וללוחות וריצוף שלהם באמצעות פלטפורמת Illumina בעלת התפוקה הגבוהה¹⁷.
   3. בצע ניתוחים ביואינפורמטיים באמצעות תוכנה זמינה מסחרית כדי לקבל מידע טקסונומי על טוהר ומינים עבור כל תרבות.
   4. טפחו את חמשת החיידקים הטהורים השופעים ביותר על ידי תרבית קו רציף והשתמשו בגליצרול כדי לשמר את החיידקים בטמפרטורה של -80°C.

3. בניית קהילות מיקרוביאליות סינתטיות

1. תרבות ביופילם משוחזרת
   הערה: לקבלת פרטים, עיין ב- Ren et ^al.18. 5 הזנים מתאימים ל-31 שילובים סינתטיים, כולל 5 מינים בודדים, 10 שני מינים, 10 שלושה מינים, 5 ארבעה מינים וקונסורציום אחד של חמישה מינים.
   1. דוגרים על 5 הזנים בתווך TSB עד שה-OD₆₀₀ שלהם מגיע ל-1 כדי להפעיל אותם.
   2. הכינו מספר צלחות 24 בארות עם TSB בינוני והניחו עליהן מסנני תאי ניילון בגודל 100 מיקרומטר.
      הערה: אם הביופילם מהשלב האחרון אינו מעובד היטב, מדיום TSB-MSgg הוא תחליף יעיל למדיום TSB.
   3. לדגור על 31 שילובים של קהילות סינתטיות במדיום. ודא שמספר החיידקים החיסוני עקבי בכל באר. הגדר שלוש חזרות לכל שילוב.
   4. טפחו את הביופילם בטמפרטורה של 30°C למשך 36 שעות.
2. כימות של ביופילם כדורי
   1. בצע את אותו הליך כמו בשלב 2.2.3.
   2. מעבירים את הביופילם לצלחת חדשה בת 24 בארות המכילה 180 מיקרוליטר של תמיסת קריסטל סגול ומכתימים אותה למשך 20 דקות.
   3. העבירו את הדגימה המוכתמת לצלחת אחרת בת 24 בארות המכילה 200 מיקרוליטר של 96% אתנול, פזרו אותה למשך 30 דקות ומדדו OD₅₉₀.

4. כימות מספר תא פליקל

הערה: כדי לקבוע את היחס של כל מין ואת ספירת התאים בתמיסה הכדורית והנותרת, יש צורך ב- PCR כמותי. לקבלת פרטים, עיין ב- Sun et ^al.16.

1. תכננו פריימרים ספציפיים לזנים עבור קהילות החיידקים הסינתטיים שנבחרו.
2. השתמש ברוארי כדי לבצע השוואות גנום ולגלות את הגנים הספציפיים לזן של עותק יחיד של כל מבודד. ודא כי פריימרים ממוקדים לגנים אלה.
3. ליגזה את השברים המוגברים לפלסמידים PMD19T. צור עקומות סטנדרטיות באמצעות פלסמידים המכילים מקטעים מתאימים כתבניות.
4. בצע את אותם השלבים שהוזכרו בשלב 2.2.
5. הכן רכיבי תגובה באופן הבא: 7.2 μL של H₂O, 10 μL של 2x qPCR Master mix, 0.4 μL של 10 μM של כל פריימר, ו- 2 μL DNA של תבנית.
6. בצע PCR עם מכשיר PCR בזמן אמת בתנאים הבאים: 95 ° C למשך 10 דקות, 40 מחזורים של 95 ° C עבור 30 שניות, ו- 60 ° C במשך 45 שניות, ולאחר מכן קטע עקומת התכה סטנדרטי.
7. בצע שישה שכפולים ביולוגיים עבור כל טיפול.

תוצאות

בעקבות ההליך שהוזכר, נצפים שיפועים משמעותיים ביכולת יצירת הביופילם ממיקרוביוטת הקרקע של ריזוספרה מלפפון (איור 1). ריצוף אמפליקון ביופילם אישר את המין בכדורית (איור 2). בהתבסס על מיפוי החום של נתוני ריצוף, נבחרו חמשת מיני החיידקים המובילים שהשפע שלהם בכדורית ...

Discussion

בהתאם לפרוטוקול, נבנות סדרה של קהילות ביופילם סינתטיות חזקות המבוססות על המיקרוביוטה באדמת ריזוספרה מצמחים שונים. באמצעות טכניקות PCR כמותיות, הרכב כל קהילה מפוענח בבירור. הביומסה של הביופילם מצביעה על עוצמת האינטראקציות המטבוליות הפוטנציאליות שלהם, אם כי תכונות ומנגנונים שונים מאחורי ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.