Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Resumen

La biopelícula multiespecie es un estilo de vida natural y dominante de las bacterias en la naturaleza, incluso en el suelo de la rizosfera, aunque su comprensión actual es limitada. Aquí, proporcionamos un enfoque para establecer rápidamente comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecies. El primer paso es extraer células del suelo de la rizosfera utilizando el método de centrifugación diferencial. Posteriormente, estas células del suelo se inoculan en el medio de cultivo para formar una biopelícula películo. Después de 36 h de incubación, la composición bacteriana de la biopelícula y la solución subyacente se determinan utilizando el método de secuenciación de amplicones del gen ARNr 16S. Mientras tanto, el aislamiento bacteriano de alto rendimiento de la biopelícula de la película se lleva a cabo utilizando el método de dilución limitante. A continuación, se seleccionan los 5 taxones bacterianos principales con la mayor abundancia en los datos de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA (muestras de biopelícula películo) para su posterior uso en la construcción de comunidades de biopelículas multiespecie. Todas las combinaciones de los 5 taxones bacterianos se establecieron rápidamente utilizando una placa de 24 pocillos, seleccionadas por la mayor capacidad de formación de biopelículas mediante el ensayo de tinción de violeta cristalino y cuantificadas por qPCR. Finalmente, las comunidades de biopelículas bacterianas sintéticas multiespecie más robustas se obtuvieron a través de los métodos anteriores. Esta metodología proporciona orientación informativa para la realización de investigaciones sobre la biopelícula multiespecie de la rizosfera y la identificación de comunidades representativas para estudiar los principios que rigen las interacciones entre estas especies.

Introducción

Las biopelículas representan comunidades microbianas intrincadas, ya sea adheridas a superficies o unidas con interfaces. Existe un amplio reconocimiento de que la mayoría de las bacterias que se encuentran en diversos entornos, como hábitats naturales, entornos clínicos y contextos industriales, perduran dentro de las comunidades de biopelículas¹. En el suelo, la rizosfera, que abarca la superficie de la raíz y su región adyacente de 2 mm de espesor, forma un nicho ecológico con una mayor disponibilidad de nutrientes. Bacterias específicas han desarrollado estrategias para explotar este nicho, fomentando la proliferación microbiana y fomentando la formación de comunidades de biopelículas en la rizosfera².

Los microbios de la rizosfera se consideran el "segundo genoma" de las plantas³. Los microorganismos promotores del crecimiento vegetal (PGPM) participan en simbiosis mutualista con las plantas, proporcionando importantes funciones de promoción del crecimiento y biocontrol⁴. Por un lado, el PGPM puede suministrar nutrientes a las raíces de las plantas, mejorar la absorción de nutrientes, defenderse contra patógenos y degradar contaminantes en el suelo de la rizosfera⁵. Por otro lado, el PGPM utiliza los exudados de las raíces de las plantas como fuente de nutrientes para el crecimiento y la evolución, influyendo así en el suelo de la rizosfera y el sistema radicular a través de su propio metabolismo. Vale la pena señalar que el requisito previo para todas estas funciones es la colonización efectiva de PGPM en la rizosfera de la planta, formando biopelículas estables⁶.

La biopelícula de la rizosfera afecta el proceso de ensamblaje de los microbios de la rizosfera, y las características temporales y espaciales del ensamblaje de los microbios de la rizosfera están estrechamente relacionadas con la interacción de la biopelícula multiespecie⁷. Sirve como centro de interacciones planta-microbioma, proporcionando un nicho estable y controlable para que interactúen de manera efectiva. Por lo tanto, el estudio de la biopelícula de la rizosfera también es una dirección importante para obtener información sobre la interacción entre las plantas y los microbios.

Sin embargo, en la actualidad hay poca investigación sobre las biopelículas multiespecie de la rizosfera. La alta complejidad de la composición del microbioma hace que sea difícil responder a las preguntas ecológicas fundamentales que rodean a las comunidades microbianas naturales⁸. En el proceso de los experimentos, es necesario tener en cuenta muchas condiciones, como el tipo de suelo, el tipo de planta y el gran número de comunidades microbianas. Diversos factores limitan la investigación de las biopelículas multiespecie de la rizosfera.

Para investigar más a fondo las comunidades de biopelículas multiespecie del suelo de la rizosfera, como las interacciones sinérgicas entre especies o la alimentación cruzada de metabolitos⁸, es deseable construir artificialmente una comunidad microbiana sintética simplificada, representativa, estable y manejable en condiciones de laboratorio ^9,10. Aquí, un protocolo estandarizado combina varias de las últimas técnicas microbiológicas y bioinformáticas.

Protocolo

Este protocolo es generalmente aplicable a la rizosfera de la microbiota del suelo de diversas plantas. Aquí, el pepino se usa como ejemplo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento bacteriano

1. Aislamiento del suelo de la rizosfera
   1. Cultivo de pepino
      1. Desinfecte las semillas de pepino con una solución de etanol al 75% y hipoclorito de sodio (NaClO) al 2%, luego enjuáguelas con agua estéril¹¹.
      2. Germinar las semillas en condiciones estériles y seleccionar aquellas que alcancen la etapa de dos hojas¹². Posteriormente, trasplante las plántulas de pepino germinadas constantemente a macetas que contengan 2 kg de tierra negra.
         NOTA: Se utilizan dos tipos de suelo negro de diferentes lugares en el noreste de China para reducir los errores sistemáticos.
   2. Preparación de la suspensión del suelo
      1. Prepare el tampón PBS-S utilizando la formulación: 6,33 g de NaH₂PO₄· H₂O, 16,5 g de Na₂HPO₄·7H₂O, 200 μL de Silwet L-77 y 1 L de agua destilada.
      2. Cuando las plántulas alcancen la etapa¹² de cuatro hojas, invierta la maceta y aísle las raíces junto con tierra de rizosfera de 2 mm de espesor con guantes esterilizados.
      3. Coloque las raíces en 30 mL de tampón PBS-S en un tubo de centrífuga de 50 mL. Después de agitar durante 20 minutos, filtre la suspensión a través de un filtro de celdas de nailon de 100 μm para eliminar las raíces y los sedimentos grandes.
      4. Transfiera el filtrado a otro tubo de centrífuga de 50 ml, centrifugue a 3200 x g durante 15 min a temperatura ambiente y almacene temporalmente a 4 °C.
2. Extracción de células bacterianas del suelo de la rizosfera.
   NOTA: Esta metodología adopta el método de centrifugación diferencial¹³, aunque el método de centrifugación en gradiente de densidad^{Nycodenz 14} también se aplica para este paso.
   1. Diluir la suspensión del suelo con una solución de Na₄P₂O₇ al 0,2% a 500 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 10 min para separar inicialmente los organismos del suelo.
   2. Vuelva a homogeneizar el precipitado, centrifugue a la misma velocidad baja durante 60 s y repita el proceso tres veces. Combine los sobrenadantes, centrifuérrelos a 12.000 x g durante 20 minutos y luego deseche el sobrenadante.
   3. Resuspender el precipitado en 50 mL de tampón PBS-S, constituyendo la suspensión celular bacteriana del suelo de la rizosfera.

2. Secuenciación e identificación de la microbiota del biofilm de la rizosfera

1. Preparación de los medios
   NOTA: El caldo de soja tríptico (TSB) y el glutamato de glicerol de sales mínimas (MSgg) están disponibles comercialmente. Las formulaciones a continuación son solo para referencia.
   1. Prepare el medio TSB utilizando la siguiente formulación: 15 μg/mL de triptona, 5 μg/mL de peptona de soja, 5 μg/mL de NaCl, pH = 7.
   2. Prepare el medio MSgg utilizando la siguiente formulación: 5 mM KH₂PO₄, 100 mM de ácido propano sulfónico (MOPS) 3-(N-morfolino), 2 mM MgCl₂, 700 μM CaCl₂, 50 μM MnCl₂, 50 μM FeCl₃, 1 μM ZnCl₂, 2 μM de tiamina, 0,5% glicerol, 0,5% glutamato, 50 μg/mL de triptófano, 50 μg/mL de fenilalanina, pH = 7.
   3. Para preparar los medios TSB-MSgg, mezcle los medios TSB con los medios MSgg en una proporción de 1:1 (v/v)¹⁵.
2. Cocultivo de biofilm Pellicle
   1. Incubar la suspensión celular en medio TSB a 30 °C durante la noche (normalmente 12 h) para activar las bacterias.
   2. Coloque filtros de celdas de nailon de 100 μm en placas de 24 pocillos. Incube las bacterias en medios TSB y establezca tres repeticiones. Cultivar el biofilm de la película durante 36 h a 30 °C.
      NOTA: Si el biofilm de la película del último paso no está bien cultivado, el medio TSB-MSgg es un sustituto eficaz del medio TSB.
   3. Retire el filtro que contiene la biopelícula de la película. Agregue 2 ml de tampón PBS-S a una nueva placa de células de 24 pocillos, coloque el filtro de 24 pocillos en ella para lavar la biopelícula y retire las células libres. Repite el proceso de lavado tres veces.
3. Extracción de ADN de biofilm pelicular
   1. Extraiga el genoma de la biopelícula utilizando un kit de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
4. Secuenciación de alto rendimiento
   NOTA: Las empresas de biotecnología pueden ayudar a completar los experimentos de secuenciación para la mayoría de los laboratorios. Si se necesita una composición microbiana en la solución restante, señéela en este paso. El paso de secuenciación varía en función de los instrumentos. Siga las instrucciones del fabricante. El paso 2.4.1 es solo para referencia.
   1. Amplifique las regiones V3-V4 del gen de ARNr 16S basándose en la base de datos con secuencias de genes de ARNr 16S de longitud completa. Crear OTUs de especies de acuerdo con el número mínimo de secuencias por muestra¹⁶. Agrupe las anotaciones de clasificación de especies y adquiera las composiciones de las comunidades de cada muestra.
   2. En función de los datos de secuenciación, seleccione las cinco cepas principales en términos de su abundancia relativa.
5. Aislamiento y cultivo bacteriano de alto rendimiento
   NOTA: Este paso está diseñado de acuerdo con la última metodología microbiológica y bioinformática¹⁷. El método de placa recubierta de dilución está disponible para el aislamiento bacteriano aquí, aunque requiere más tiempo y es menos específico en comparación con las técnicas de alto rendimiento.
   1. Mezclar el biofilm cultivado. Utilice la dilución limitante para asegurarse de que no más del 30% de los pocillos de la placa de 24 pocillos muestren crecimiento bacteriano.
      NOTA: Para determinar la dilución más adecuada, realice experimentos preliminares utilizando una amplia gama de tasas de dilución. La dilución óptima no debe contener más de dos bacterias cultivables por mililitro, lo que representa una incubación bacteriana en menos del 30% de los pocillos.
   2. Amplifique el gen 16S rRNA de las bacterias mientras agrega etiquetas para los pocillos y las placas y secuséntelos utilizando la plataforma Illumina¹⁷ de alto rendimiento.
   3. Realizar análisis bioinformáticos utilizando software disponible comercialmente para obtener información taxonómica de pureza y especies para cada cultivo.
   4. Cultive las cinco bacterias puras más abundantes mediante cultivo en línea continua y use glicerol para preservar las bacterias a -80 °C.

3. Construcción de comunidades microbianas sintéticas

1. Cultivo de biofilm reconstruido
   NOTA: Para más detalles, consulte Ren et ^al.18. Las 5 cepas corresponden a 31 combinaciones sintéticas, incluyendo 5 consorcios de una sola especie, 10 de dos especies, 10 de tres especies, 5 de cuatro especies y 1 de cinco especies.
   1. Incubar las 5 cepas en el medio TSB hasta que su OD₆₀₀ llegue a 1 para activarlas.
   2. Prepare varias placas de 24 pocillos con medio TSB y coloque filtros de celdas de nailon de 100 μm sobre ellas.
      NOTA: Si la biopelícula del último paso no está bien cultivada, el medio TSB-MSgg es un sustituto eficaz del medio TSB.
   3. Incuba las 31 combinaciones de comunidades sintéticas en el medio. Asegúrese de que el número de bacterias de inoculación sea constante en cada pocillo. Establece tres repeticiones para cada combinación.
   4. Cultivar el biofilm a 30 °C durante 36 h.
2. Cuantificación del biofilm de la película
   1. Siga el mismo procedimiento que en el paso 2.2.3.
   2. Transfiera la biopelícula a una nueva placa de 24 pocillos que contenga 180 μL de solución de violeta cristalina y tiña durante 20 minutos.
   3. Transfiera la muestra teñida a otra placa de 24 pocillos que contenga 200 μL de etanol al 96%, eluya durante 30 minutos y mida OD₅₉₀.

4. Cuantificación del número de células de la película

NOTA: Para determinar la proporción de cada especie y los recuentos de células en la película y la solución restante, es necesaria la PCR cuantitativa. Para más detalles, véase Sun et ^al.16.

1. Diseñar cebadores específicos de cepa para las comunidades microbianas sintéticas seleccionadas.
2. Utilice Roary para realizar comparaciones del genoma y averiguar los genes de copia única específicos de la cepa de cada cepa. Asegúrese de que los cebadores estén dirigidos a estos genes.
3. Ligasa los fragmentos amplificados a plásmidos PMD19T. Genere curvas estándar utilizando los plásmidos que contienen los fragmentos correspondientes como plantillas.
4. Siga los mismos pasos que se mencionaron en el paso 2.2.
5. Prepare los componentes de la reacción de la siguiente manera: 7,2 μL de_H2O, 10 μL de 2x mezcla maestra de qPCR, 0,4 μL de 10 μM de cada cebador y 2 μL de ADN molde.
6. Realice la PCR con un instrumento de PCR en tiempo real en las siguientes condiciones: 95 °C durante 10 min, 40 ciclos de 95 °C durante 30 s y 60 °C durante 45 s, seguidos de un segmento de curva de fusión estándar.
7. Realizar seis réplicas biológicas para cada tratamiento.

Resultados

Siguiendo el procedimiento mencionado, se observan gradientes significativos en la capacidad de formación de biopelículas de la microbiota del suelo de la rizosfera del pepino (Figura 1). La secuenciación del amplicón del biofilm confirmó la presencia de la especie en la película (Figura 2). Sobre la base del mapa de calor de los datos de secuenciación, se seleccionaron las cinco especies bacterianas principales cuya abundancia en la película es mayor qu...

Discusión

Siguiendo el protocolo, se construyen una serie de comunidades robustas de biofilm sintético multiespecie a partir de la microbiota en suelos de rizosfera de diferentes plantas. Mediante técnicas cuantitativas de PCR se descifra claramente la composición de cada comunidad. La biomasa de la biopelícula indica la fuerza de sus posibles interacciones metabólicas, aunque no se pudieron revelar aquí varias propiedades y mecanismos detrás de la cooperación¹⁹. Dado el tamaño y la complejidad de ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.