Un enfoque para la construcción de comunidades de biopelículas multiespecies a partir del suelo de la rizosfera

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento rápido y estandarizado para establecer comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecie de varios suelos de rizosfera. Se trata de un protocolo único diseñado para sondear y simular la compleja rizosfera de la microbiota del suelo.

Resumen

La biopelícula multiespecie es un estilo de vida natural y dominante de las bacterias en la naturaleza, incluso en el suelo de la rizosfera, aunque su comprensión actual es limitada. Aquí, proporcionamos un enfoque para establecer rápidamente comunidades sinérgicas de biopelículas multiespecies. El primer paso es extraer células del suelo de la rizosfera utilizando el método de centrifugación diferencial. Posteriormente, estas células del suelo se inoculan en el medio de cultivo para formar una biopelícula películo. Después de 36 h de incubación, la composición bacteriana de la biopelícula y la solución subyacente se determinan utilizando el método de secuenciación de amplicones del gen ARNr 16S. Mientras tanto, el aislamiento bacteriano de alto rendimiento de la biopelícula de la película se lleva a cabo utilizando el método de dilución limitante. A continuación, se seleccionan los 5 taxones bacterianos principales con la mayor abundancia en los datos de secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA (muestras de biopelícula películo) para su posterior uso en la construcción de comunidades de biopelículas multiespecie. Todas las combinaciones de los 5 taxones bacterianos se establecieron rápidamente utilizando una placa de 24 pocillos, seleccionadas por la mayor capacidad de formación de biopelículas mediante el ensayo de tinción de violeta cristalino y cuantificadas por qPCR. Finalmente, las comunidades de biopelículas bacterianas sintéticas multiespecie más robustas se obtuvieron a través de los métodos anteriores. Esta metodología proporciona orientación informativa para la realización de investigaciones sobre la biopelícula multiespecie de la rizosfera y la identificación de comunidades representativas para estudiar los principios que rigen las interacciones entre estas especies.

Introducción

Las biopelículas representan comunidades microbianas intrincadas, ya sea adheridas a superficies o unidas con interfaces. Existe un amplio reconocimiento de que la mayoría de las bacterias que se encuentran en diversos entornos, como hábitats naturales, entornos clínicos y contextos industriales, perduran dentro de las comunidades de biopelículas¹. En el suelo, la rizosfera, que abarca la superficie de la raíz y su región adyacente de 2 mm de espesor, forma un nicho ecológico con una mayor disponibilidad de nutrientes. Bacterias específicas han desarrollado estrategias para explotar este nicho, fomentando la proliferación microbiana y fomentand....

Protocolo

Este protocolo es generalmente aplicable a la rizosfera de la microbiota del suelo de diversas plantas. Aquí, el pepino se usa como ejemplo. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento bacteriano

1. Aislamiento del suelo de la rizosfera
   1. Cultivo de pepino
      1. Desinfecte las semillas de pepino con una solución de etanol al 75% y hipoclorito de sodio (NaClO) al 2%, luego enjuáguelas con agua estéril¹¹.
      2. Germinar las semillas en condiciones estériles y seleccionar aquellas que alcance....

Discusión

Siguiendo el protocolo, se construyen una serie de comunidades robustas de biofilm sintético multiespecie a partir de la microbiota en suelos de rizosfera de diferentes plantas. Mediante técnicas cuantitativas de PCR se descifra claramente la composición de cada comunidad. La biomasa de la biopelícula indica la fuerza de sus posibles interacciones metabólicas, aunque no se pudieron revelar aquí varias propiedades y mecanismos detrás de la cooperación¹⁹. Dado el tamaño y la complejidad de .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.