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요약

다양한 rhizosphere 토양에서 시너지 효과가 있는 다종 생물막 군집을 구축하기 위한 빠르고 표준화된 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 이는 복잡한 rhizosphere 토양 미생물군을 조사하고 시뮬레이션하도록 설계된 고유한 프로토콜입니다.

초록

다종 생물막은 뿌리권 토양을 포함하여 자연에서 자연적으로 발생하는 박테리아의 지배적 인 생활 방식이지만 현재의 이해는 제한적입니다. 여기에서 우리는 시너지 효과가 있는 다종 생물막 커뮤니티를 신속하게 구축할 수 있는 접근 방식을 제공합니다. 첫 번째 단계는 차등 원심분리 방법을 사용하여 근권 토양에서 세포를 추출하는 것입니다. 그 후, 이러한 토양 세포를 배양 배지에 접종하여 펠리클 생물막을 형성합니다. 36시간의 배양 후 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱 방법을 사용하여 생물막의 박테리아 조성과 그 아래의 용액을 결정합니다. 한편, 펠리클 생물막에 대한 고처리량 세균 분리는 제한 희석 방법을 사용하여 수행됩니다. 그런 다음, 16S rRNA 유전자 앰플리콘 시퀀싱 데이터(펠리클 생물막 샘플)에서 가장 풍부도가 높은 상위 5개의 박테리아 분류군을 선택하여 다종 생물막 군집을 구축하는 데 추가로 사용합니다. 5가지 박테리아 분류군의 모든 조합은 24웰 플레이트를 사용하여 신속하게 확립되었으며, 결정 보라색 염색 분석에 의해 가장 강력한 생물막 형성 능력을 위해 선택되었으며 qPCR로 정량화되었습니다. 마지막으로, 가장 강력한 합성 박테리아 다종 생물막 군집은 위의 방법을 통해 얻어졌습니다. 이 방법론은 rhizosphere multispecies biofilm에 대한 연구를 수행하고 이러한 종 간의 상호 작용을 지배하는 원칙을 연구하기 위한 대표 군집을 식별하기 위한 유익한 지침을 제공합니다.

서문

생물막은 표면에 부착되거나 계면으로 연결된 복잡한 미생물 군집을 나타냅니다. 자연 서식지, 임상 환경 및 산업 맥락과 같은 다양한 환경에서 발견되는 대부분의 박테리아가 생물막 군집 내에서 지속된다는 광범위한 인정이 있습니다1. 토양에서 뿌리 표면과 인접한 2mm 두께의 영역을 포함하는 뿌리권은 영양 가용성이 높은 생태학적 틈새를 형성합니다. 특정 박테리아는 이 틈새를 활용하기 위한 전략을 진화시켜 미생물 증식을 촉진하고 뿌리권에서 생물막 군집의 형성을 촉진했다2.

Rhizosphere 미생물은 식물의 '두 번째 게놈'으로 간주됩니다3. 식물 성장 촉진 미생물(PGPM)은 식물과 상호 공생하여 중요한 성장 촉진 및 생물 제어 기능을 제공합니다4. 한편으로, PGPM은 식물 뿌리에 영양분을 공급하고, 영양분 흡수를 촉진하고, 병원균에 대한 방어를 하고, 뿌리권 토양의 오염 물질을 분해할 수 있다5. 반면에 PGPM은 식물 뿌리 삼출물을 성장과 진화를 위한 영양 공급원으로 활용하여 자신의 신진대사를 통해 근권 토양과 뿌리 시스템에 영향을 미칩니다. 이러한 모든 기능의 전제 조건은 식물 뿌리권에서 PGPM의 효과적인 집락화로 안정적인 생물막을 형성하는 것이라는 점은 주목할 가치가 있습니다6.

Rhizosphere biofilm은 rhizosphere microbes의 조립 과정에 영향을 미치며, rhizosphere microbe assembly의 시간적 및 공간적 특성은 다종 생물막7의 상호 작용과 밀접한 관련이 있습니다. 이는 식물-미생물 상호 작용의 허브 역할을 하여 식물-미생물 상호 작용이 효과적으로 상호 작용할 수 있는 안정적이고 제어 가능한 틈새를 제공합니다. 따라서 rhizosphere biofilm을 연구하는 것은 식물과 미생물 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 얻는 중요한 방향이기도합니다.

그러나 현재 rhizosphere multispecies biofilms에 대한 연구는 거의 없습니다. 마이크로바이옴 구성의 높은 복잡성으로 인해 자연 미생물 군집을 둘러싼 근본적인 생태학적 질문에 답하기가 어렵습니다8. 실험 과정에서 토양 유형, 식물 유형 및 많은 수의 미생물 군집과 같은 많은 조건을 고려해야 합니다. 다양한 요인이 rhizosphere multispecies biofilms의 연구를 제한합니다.

종간 시너지 상호작용 또는 대사산물교차 섭식8과 같은 뿌리권 토양으로부터의 다종 생물막 군집을 추가로 조사하기 위해서는, 실험실 조건 하에서 단순화되고, 대표적이며, 안정적이고, 다루기 쉬운 합성 미생물 군집을 인위적으로 구축하는 것이 바람직하다(9,10). 여기에서 표준화된 프로토콜은 여러 최신 미생물학 및 생물정보학 기술을 결합합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 일반적으로 다양한 식물의 뿌리권 토양 미생물군에 적용할 수 있습니다. 여기에서는 오이를 예로 듭니다. 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세균 분리

  1. Rhizosphere 토양 격리
    1. 오이 문화
      1. 75% 에탄올과 2% 차아염소산나트륨(NaClO) 용액으로 오이 씨앗을 소독한 다음 멸균수11로 헹굽니다.
      2. 멸균 상태에서 씨앗을 발아시키고 두 잎 단계12에 도달하는 씨앗을 선택하십시오. 그 후, 일관되게 싹이 트는 오이 묘목을 2kg의 검은 흙이 들어있는 화분에 이식하십시오.
        참고: 중국 북동부의 서로 다른 위치에서 채취한 두 가지 유형의 흑토를 사용하여 시스템 오류를 줄입니다.
    2. 토양 현탁액 준비
      1. 제형을 사용하여 PBS-S 완충액을 제조합니다 :NaH2PO46.33g· H2O, Na2HPO4·7H2O 16.5g, Silwet L-77 200 μL 및 증류수 1 L.
      2. 묘목이 네 잎 단계12에 도달하면 화분을 뒤집어 살균 장갑을 사용하여 2mm 두께의 뿌리 흙과 함께 뿌리를 분리합니다.
      3. 50mL 원심분리기 튜브에 30mL의 PBS-S 완충액에 뿌리를 넣습니다. 20분 동안 흔든 후 100μm 나일론 셀 필터를 통해 현탁액을 여과하여 뿌리와 큰 침전물을 제거합니다.
      4. 여과액을 다른 50mL 원심분리 튜브로 옮기고 실온에서 3200 x g 에서 15분 동안 원심분리한 후 4°C에서 임시로 보관합니다.
  2. rhizosphere 토양 박테리아 세포의 추출.
    참고: 이 방법은 차등 원심분리 방법(13)을 채택하지만, Nycodenz 밀도 구배 원심분리 방법(14 )도 이 단계에 적용됩니다.
    1. 토양 현탁액을 0.2 % Na4P2O7 용액으로 500 mL에 희석하고 1,000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리하여 처음에 토양에서 유기체를 분리합니다.
    2. 침전물을 다시 균질화하고 60초 동안 동일한 저속으로 원심분리한 다음 이 과정을 세 번 반복합니다. 상층액을 결합하고 12,000 x g 에서 20분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
    3. 50mL의 PBS-S 완충액에 침전물을 재현탁시켜 rhizosphere soil bacterial cell suspension을 구성합니다.

2. rhizosphere biofilm microbiota의 염기서열 분석 및 식별

  1. 미디어 준비
    참고: 트립틱 대두 육수(TSB) 및 미니멀 솔트 글리세롤 글루타메이트(MSgg) 배지는 상업적으로 이용 가능합니다. 아래 정립은 참고용입니다.
    1. 15 μg/mL 트립톤, 5 μg/mL 대두 펩톤, 5 μg/mL NaCl, pH = 7 제형을 사용하여 TSB 배지를 준비합니다.
    2. 다음 제형을 사용하여 MSgg 배지를 제조합니다: 5 mM KH2PO4, 100 mM 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산(MOPS), 2 mM MgCl2, 700 μM CaCl2, 50 μM MnCl2, 50 μM FeCl3, 1 μM ZnCl2, 2 μM 티아민, 0.5% 글리세롤, 0.5% 글루타메이트, 50 μg/mL 트립토판, 50 μg/mL 페닐알라닌, pH = 7.
    3. TSB-MSgg 미디어를 준비하려면 TSB 미디어와 MSgg 미디어를 1:1 비율(v/v)로 혼합합니다15.
  2. 펠리클 생물막 공동 배양
    1. 세포 현탁액을 30°C의 TSB 배지에서 하룻밤 동안(보통 12시간) 배양하여 박테리아를 활성화합니다.
    2. 100μm 나일론 셀 필터를 24웰 플레이트에 놓습니다. TSB 배지에서 박테리아를 배양하고 3회 반복합니다. 펠리클 생물막을 30°C에서 36시간 동안 배양합니다.
      참고: 마지막 단계의 펠리클 생물막이 잘 배양되지 않은 경우 TSB-MSgg 배지가 TSB 배지를 대체하는 효과적인 대안입니다.
    3. 펠리클 바이오필름이 포함된 필터를 제거합니다. 새로운 24웰 셀 플레이트에 PBS-S 완충액 2mL를 추가하고 24웰 필터를 삽입하여 생물막을 세척한 다음 자유 세포를 제거합니다. 세탁 과정을 세 번 반복합니다.
  3. 펠리클 생물막 DNA 추출
    1. 제조업체의 지침에 따라 DNA 키트를 사용하여 생물막 게놈을 추출합니다.
  4. 고처리량 염기서열분석(High-throughput sequencing)
    참고: 생명공학 회사는 대부분의 실험실에서 염기서열분석 실험을 완료하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 나머지 용액의 미생물 조성이 필요한 경우 이 단계에서 염기서열을 분석합니다. 염기서열분석 단계는 기기에 따라 다릅니다. 제조업체의 지침을 따르십시오. 2.4.1단계는 참고용입니다.
    1. 전장 16S rRNA 유전자 염기서열로 데이터베이스를 기반으로 16S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 증폭합니다. 샘플당 최소 염기서열 수에 따라 종 OTU를 생성합니다16. 종 분류 주석을 클러스터링하고 각 샘플에서 군집의 구성을 획득합니다.
    2. 염기서열분석 데이터를 기반으로 상대적 풍부도 측면에서 상위 5개 균주를 선택합니다.
  5. 고처리량 박테리아 분리 및 배양
    참고: 이 단계는 최신 미생물 및 생물정보학 방법론17에 따라 설계되었습니다. 희석 코팅 플레이트 방법은 여기에서 박테리아 분리에 사용할 수 있지만 고처리량 기술에 비해 시간이 더 많이 걸리고 표적화가 적습니다.
    1. 배양된 생물막을 혼합합니다. 제한 희석을 사용하여 24웰 플레이트에 있는 웰의 30% 이상이 박테리아 성장을 보이지 않도록 합니다.
      참고: 가장 적합한 희석을 결정하려면 광범위한 희석 속도를 사용하여 예비 실험을 수행하십시오. 최적의 희석액에는 밀리리터당 배양 가능한 박테리아가 2개 이하로 포함되어야 하며, 이는 웰의 30% 미만에서 박테리아 배양을 나타냅니다.
    2. 박테리아의 16S rRNA 유전자를 증폭하는 동시에 웰 및 플레이트에 대한 라벨을 추가하고 고처리량 Illumina 플랫폼17을 사용하여 염기서열을 분석합니다.
    3. 각 배양에 대한 순도 및 종 분류학 정보를 얻기 위해 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어를 사용하여 생물정보학 분석을 수행합니다.
    4. 연속 라인 배양으로 상위 5개의 풍부한 순수 박테리아를 배양하고 글리세롤을 사용하여 박테리아를 -80 °C에서 보존합니다.

3. 합성 미생물 군집의 구축

  1. 재건된 생물막 배양
    참고: 자세한 내용은 Ren et al.18을 참조하십시오. 5 종은 5 개의 단일 종, 10 개의 2 종, 10 개의 3 종, 5 개의 4 종 및 1 개의 5 종 컨소시엄을 포함하여 31 개의 합성 조합에 해당합니다.
    1. OD600 이 1에 도달할 때까지 TSB 배지에서 5개의 균주를 배양하여 활성화합니다.
    2. TSB 배지가 있는 여러 개의 24웰 플레이트를 준비하고 그 위에 100μm 나일론 셀 필터를 놓습니다.
      참고: 마지막 단계의 생물막이 잘 배양되지 않은 경우 TSB-MSgg 배지가 TSB 배지를 대체하는 효과적인 방법입니다.
    3. 배지에서 합성 군집의 31 가지 조합을 배양합니다. 각 웰에서 박테리아의 접종 횟수가 일정한지 확인하십시오. 각 조합에 대해 3회 반복을 설정합니다.
    4. 30°C에서 36시간 동안 생물막을 배양합니다.
  2. 펠리클 생물막의 정량화
    1. 2.2.3단계와 동일한 절차를 따릅니다.
    2. 생물막을 180μL의 결정 보라색 용액이 포함된 새로운 24웰 플레이트로 옮기고 20분 동안 염색합니다.
    3. 염색된 샘플을 200μL의 96% 에탄올이 들어 있는 다른 24웰 플레이트로 옮기고 30분 동안 용리한 다음 OD590을 측정합니다.

4. 펠리클 세포 수 정량화

참고: 펠리클 및 나머지 용액에서 각 종의 비율과 세포 수를 확인하려면 정량적 PCR이 필요합니다. 자세한 내용은 Sun et al.16을 참조하십시오.

  1. 선택한 합성 미생물 군집을 위한 균주 특이적 프라이머를 설계합니다.
  2. Roary를 사용하여 게놈 비교를 수행하고 각 분리체의 균주 특이적 단일 복제 유전자를 찾으십시오. 프라이머가 이러한 유전자를 대상으로 하는지 확인하십시오.
  3. 증폭된 단편을 PMD19T 플라스미드에 리가스합니다. 해당 fragment를 포함하는 plasmid를 template로 사용하여 표준 곡선을 생성합니다.
  4. 2.2단계에서 언급한 것과 동일한 단계를 수행합니다.
  5. 7.2 μL의 H2O, 10 μL의 2x qPCR 마스터 믹스, 0.4 μL의 각 프라이머 10 μM, 2 μL 템플릿 DNA와 같이 반응 성분을 준비합니다.
  6. 95°C에서 10분, 95°C에서 30초, 60°C에서 45초 동안 40주기 동안 Real-time PCR 기기로 PCR을 수행한 후 표준 용융 곡선 세그먼트를 수행합니다.
  7. 각 치료에 대해 6개의 생물학적 복제를 수행합니다.

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결과

언급된 절차에 따라, 오이 뿌리권 토양 미생물군으로부터 생물막 형성 능력의 상당한 구배가 관찰됩니다(그림 1). 생물막 앰플리콘 시퀀싱을 통해 펠리클의 종을 확인했습니다(그림 2). 염기서열 분석 데이터의 히트 매핑을 기반으로 펠리클의 풍부도가 나머지 용액의 농도보다 큰 상위 5개의 박테리아 종을 선택했습니다(그림 3). ?...

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토론

프로토콜에 따라, 다양한 식물의 뿌리권 토양에 있는 미생물군을 기반으로 일련의 강력한 합성 다종 생물막 군집이 구성됩니다. 정량적 PCR 기술을 사용하여 각 커뮤니티의 구성을 명확하게 해독합니다. 생물막의 바이오매스는 잠재적인 대사 상호 작용의 강도를 나타내지만, 협력 이면의 다양한 특성과 메커니즘은 여기에서 밝힐 수 없습니다19. 자연 미생물 군집의 규모와 복잡?...

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공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립자연과학재단(42307173 및 42107328)과 국가 핵심 연구 개발 프로그램(2022YFD1500202 및 2022YFF1001800)의 재정 지원을 받았습니다. P.W, Z.X가 연구를 설계했습니다. P.W, B.X, Z.C, J.X, N.Z는 데이터를 분석하고 수치를 만들었습니다. P.W는 원고의 첫 번째 초안을 썼습니다. Z.X., R.Z. 및 Q.S.가 원고를 수정하였다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 % Na4P2O7 solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.20041418Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell FilterSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.F613463-0001Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.L03336903Used to sterilize the seeds.
24-well PlateMerck & Co., Inc.PSRP010Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)Bioolook Scientific Research Special2360010Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge TubeBeijing Su-bio Biotech Co., Ltd.62.547.254Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.801769680Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA KitNanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.D3350020000K04U021Used to extract bacterial DNA.
Black Soil INanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Jilin Province.
Black Soil IINanjing Agricultural UniversityN/ABlack soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2Nanjing Agricultural UniversityN/AStrains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10035048Used to prepare MSgg media.
CentrifugeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.G508009-0001High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master MixVazyme Biotech Co.,Ltd.Q311-02Used for DNA amplification in qPCR.
Clean BenchSuzhou Antai Airtech Co., Ltd.NB026143Used for aseptic operation.
Constant Temperature IncubatorShangHai CIMO Medical Instrument Co.,LtdGNP-9080BS-figure-materials-2598Used for microbial cultivation.
Cristal Violet DyeSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.A600331Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber SeedNanjing Agricultural UniversityN/A"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of SciencesN/AUsed for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10011918Used to prepare MSgg media.
FridgeHefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.BCD-556WKPM(Q)Used for strain preservation.
GlutamateBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
GlycerolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010618Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting BasketYulv Furniture Store6526262626Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4Xilong Scientific Co.,Ltd.10017618Used to prepare MSgg media.
MgCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.7791186Used to prepare MSgg media.
MnCl2Xilong Scientific Co.,Ltd.10400101Used to prepare MSgg media.
Msgg MediumShanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.BES20791KBPellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2OMerck & Co., Inc.S9390-100GUsed to prepare TSB media.
NaCIChinasun Specialty Products co., Ltd.HS0416Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2OMerck & Co., Inc.S9638-25GUsed to prepare TSB media.
PBS-S BufferSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.E607008-0001Basic buffer for living tissues.
PhenylalanineRYONRT3486L005Used to prepare MSgg media.
PipetteBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.BS-1000-TUsed for strain inoculation.
PMD19T PlasmidTakara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.D102AUsed to generate qPCR standard curves.
PotSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.YHHWS2401Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCRSangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR InstrumentThermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.4484073Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
RoaryThe Wellcome Trust SangerInstituteN/AUsed to design primers of qPCR
ShakerShanghai Zhichu Instrument Co.,LtdZQTY-50SUsed for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.SL77080596Used to prepare TSB media.
Soy peptoneQingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., LtdHB8275Used to prepare TSB media.
SpectrophotometerShanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.76713100010Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile WaterSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.SW150302Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile GlovesBeijing Labgic Technology Co.,Ltd.223016852LLZAUsed for basic experimental operations.
Template DNASangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.N/AUsed for DNA amplification in qPCR.
ThiamineBioolook Scientific Research Special2180020Used to prepare MSgg media.
TryptoneThermo Fisher ScientificLP0042BUsed to prepare TSB media.
TryptophanBioolook Scientific Research Special2190020Used to prepare MSgg media.
TSB MediumGuangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.024048Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg MeidiumNanjing Agricultural UniversityN/AMixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2Nanjing Chemical Reagent Co.,LtdC0310520123Used to prepare MSgg media.

참고문헌

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