Un approccio alla costruzione di comunità di biofilm multispecie dal suolo della rizosfera

Riepilogo

Qui viene presentata una procedura rapida e standardizzata per stabilire comunità di biofilm multispecie sinergiche da vari suoli della rizosfera. Si tratta di un protocollo unico progettato per sondare e simulare il complesso microbiota del suolo della rizosfera.

Abstract

Il biofilm multispecie è uno stile di vita naturale e dominante dei batteri in natura, anche nel suolo della rizosfera, sebbene l'attuale comprensione di esso sia limitata. Qui, forniamo un approccio per stabilire rapidamente comunità di biofilm multispecie sinergiche. Il primo passo consiste nell'estrarre le cellule dal terreno della rizosfera utilizzando il metodo della centrifugazione differenziale. Successivamente, queste cellule del suolo vengono inoculate nel terreno di coltura per formare il biofilm della pellicola. Dopo 36 ore di incubazione, la composizione batterica del biofilm e la soluzione sottostante vengono determinate utilizzando il metodo di sequenziamento dell'amplicone genico 16S rRNA. Nel frattempo, l'isolamento batterico ad alto rendimento dal biofilm della pellicola viene condotto utilizzando il metodo di diluizione limitante. Quindi, i primi 5 taxa batterici vengono selezionati con la più alta abbondanza nei dati di sequenziamento dell'amplicone del gene 16S rRNA (campioni di biofilm a pellicola) per un ulteriore utilizzo nella costruzione di comunità di biofilm multispecie. Tutte le combinazioni dei 5 taxa batterici sono state rapidamente stabilite utilizzando una piastra a 24 pozzetti, selezionata per la più forte capacità di formazione del biofilm mediante il saggio di colorazione cristallovioletto e quantificata mediante qPCR. Infine, le più robuste comunità di biofilm batterici multispecie sintetiche sono state ottenute attraverso i metodi di cui sopra. Questa metodologia fornisce una guida informativa per condurre ricerche sul biofilm multispecie della rizosfera e identificare comunità rappresentative per studiare i principi che governano le interazioni tra queste specie.

Introduzione

I biofilm rappresentano intricate comunità microbiche fissate alle superfici o collegate con interfacce. C'è un ampio riconoscimento che la maggior parte dei batteri incontrati in vari ambienti, come habitat naturali, ambienti clinici e contesti industriali, sopravvive all'interno delle comunità di biofilm¹. Nel suolo, la rizosfera, che comprende la superficie delle radici e la sua adiacente regione spessa 2 mm, forma una nicchia ecologica con una maggiore disponibilità di nutrienti. Batteri specifici hanno sviluppato strategie per sfruttare questa nicchia, favorendo la proliferazione microbica e favorendo la formazione di comunità di biofilm n....

Protocollo

Questo protocollo è generalmente applicabile al microbiota del suolo della rizosfera di varie piante. Qui, il cetriolo è usato come esempio. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate per lo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Isolamento batterico

1. Isolamento del suolo nella rizosfera
   1. Cultura del cetriolo
      1. Disinfettare i semi di cetriolo con una soluzione di etanolo al 75% e ipoclorito di sodio (NaClO) al 2%, quindi sciacquarli in acqua sterile¹¹.
      2. Germina i semi in condizioni sterili e seleziona quelli che raggiungono lo....

Discussione

Seguendo il protocollo, una serie di robuste comunità di biofilm sintetici multispecie sono costruite sulla base del microbiota nel suolo della rizosfera di diverse piante. Utilizzando tecniche di PCR quantitativa, la composizione di ciascuna comunità viene decifrata in modo chiaro. La biomassa del biofilm indica la forza delle loro potenziali interazioni metaboliche, anche se non è stato possibile rivelare qui varie proprietà e meccanismi alla base della cooperazione¹⁹. Date le dimensioni e l.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 % Na4P2O7 solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	20041418	Used to dilute the soil suspension.
100 μm Nylon Cell Filter	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	F613463-0001	Used to filter culture solution and separate pellicle biofilm.
2% NaClO solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	L03336903	Used to sterilize the seeds.
24-well Plate	Merck & Co., Inc.	PSRP010	Used for micobial cultivation and pellicle biofilm separation.
3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS)	Bioolook Scientific Research Special	2360010	Used to prepare MSgg media.
50 mL Centrifuge Tube	Beijing Su-bio Biotech Co., Ltd.	62.547.254	Properly-sized centrifuge tubes for our protocol.
75% C2H5OH solution	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	801769680	Used to sterilize the seeds.
Acinetobacter baumannii XL-1	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacillus velezensis SQR9	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
Bacteria DNA Kit	Nanjing Dinsi Biotechnology Co.,Ltd.	D3350020000K04U021	Used to extract bacterial DNA.
Black Soil I	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Jilin Province.
Black Soil II	Nanjing Agricultural University	N/A	Black soil from Heilongjiang Province.
Burkholderia cenocepacia XL-2	Nanjing Agricultural University	N/A	Strains isolated from rhizosphere soil.
CaCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10035048	Used to prepare MSgg media.
Centrifuge	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	G508009-0001	High-speed centrifuge.
ChamQ SYBR qPCR Master Mix	Vazyme Biotech Co.,Ltd.	Q311-02	Used for DNA amplification in qPCR.
Clean Bench	Suzhou Antai Airtech Co., Ltd.	NB026143	Used for aseptic operation.
Constant Temperature Incubator	ShangHai CIMO Medical Instrument Co.,Ltd	GNP-9080BS-	Used for microbial cultivation.
Cristal Violet Dye	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	A600331	Used for pellicle biofilm staining and quantifivation.
Cucumber Seed	Nanjing Agricultural University	N/A	"Jinchun I" cucumber seed.
Culturome v 1.0	The Institute of Genetics and Developmental Biology of the Chinese Academy of Sciences	N/A	Used for high-throughput rhizosphere soil bacterial cultivation and identification
FeCl3	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10011918	Used to prepare MSgg media.
Fridge	Hefei Midea Refrigerator Co.,Ltd.	BCD-556WKPM(Q)	Used for strain preservation.
Glutamate	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Glycerol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd	10010618	Used to prepare MSgg media.
Hydroponic Planting Basket	Yulv Furniture Store	6526262626	Used for cucumber hydroponics.
KH2PO4	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10017618	Used to prepare MSgg media.
MgCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	7791186	Used to prepare MSgg media.
MnCl2	Xilong Scientific Co.,Ltd.	10400101	Used to prepare MSgg media.
Msgg Medium	Shanghai Bioesn Biotechnology Co.,Ltd.	BES20791KB	Pellicle biofilm culture medium.
Na2HPO4·7H2O	Merck & Co., Inc.	S9390-100G	Used to prepare TSB media.
NaCI	Chinasun Specialty Products co., Ltd.	HS0416	Used to prepare TSB media.
NaH2PO4·H2O	Merck & Co., Inc.	S9638-25G	Used to prepare TSB media.
PBS-S Buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	E607008-0001	Basic buffer for living tissues.
Phenylalanine	RYON	RT3486L005	Used to prepare MSgg media.
Pipette	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	BS-1000-T	Used for strain inoculation.
PMD19T Plasmid	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co.,Ltd.	D102A	Used to generate qPCR standard curves.
Pot	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	YHHWS2401	Used for cucumber soil culture.
Primer for qPCR	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Real-Time PCR Instrument	Thermo Fisher Scientific (China) Co.,Ltd.	4484073	Used to perform qPCR on selected pellicle biofilm.
Roary	The Wellcome Trust SangerInstitute	N/A	Used to design primers of qPCR
Shaker	Shanghai Zhichu Instrument Co.,Ltd	ZQTY-50S	Used for solution mixing and microbial cultivation.
Silwet L-77	Cytiva Bio-technology(Hangzhou) Co., Ltd.	SL77080596	Used to prepare TSB media.
Soy peptone	Qingdao Hi-tech Industrial Park Hope Bio-technology Co., Ltd	HB8275	Used to prepare TSB media.
Spectrophotometer	Shanghai Yidian Analysis Instrument Co.,Ltd.	76713100010	Used for pellicle biofilm cristal violet quantifivation.
Sterile Water	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd.	SW150302	Used to wash the pellicle biofilm.
Sterilized Nitrile Gloves	Beijing Labgic Technology Co.,Ltd.	223016852LLZA	Used for basic experimental operations.
Template DNA	Sangon Biotech (Shanghai) Co.,Ltd.	N/A	Used for DNA amplification in qPCR.
Thiamine	Bioolook Scientific Research Special	2180020	Used to prepare MSgg media.
Tryptone	Thermo Fisher Scientific	LP0042B	Used to prepare TSB media.
Tryptophan	Bioolook Scientific Research Special	2190020	Used to prepare MSgg media.
TSB Medium	Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co.,Ltd.	024048	Broad-spectrum bacterial medium.
TSB-Msgg Meidium	Nanjing Agricultural University	N/A	Mixed medium for pellicle biofilm culture with wider applicability.
ZnCl2	Nanjing Chemical Reagent Co.,Ltd	C0310520123	Used to prepare MSgg media.