التثقيب الكهربائي القائم على الركيزة المسامية مع مراقبة المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة

Summary

أزواج التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) توصيل متسق وعالي الإنتاجية مع قابلية عالية للخلية. يوفر إدخال قياسات المعاوقة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI) نظرة ثاقبة للعمليات الوسيطة ل PSEP ويسمح بالتسليم بدون ملصقات. تتناول هذه المقالة طريقة لإجراء تجارب تسليم PSEP وتحليل قياس TEEI في وقت واحد.

Abstract

التثقيب الكهربائي للركيزة المسامية (PSEP) هو طريقة ناشئة للتثقيب الكهربائي توفر إنتاجية عالية وتسليما متسقا. مثل العديد من الأنواع الأخرى من التسليم داخل الخلايا ، يعتمد PSEP بشكل كبير على علامات الفلورسنت والفحص المجهري الفلوري لتحديد التسليم الناجح. لاكتساب نظرة ثاقبة على الخطوات الوسيطة لعملية التثقيب الكهربائي ، تم تطوير منصة PSEP مع مراقبة متكاملة للمقاومة الكهربائية عبر الظهارة (TEEI). يتم استزراع الخلايا في إدخالات متاحة تجاريا مع أغشية مسامية. بعد فترة حضانة مدتها 12 ساعة للسماح بتكوين طبقة أحادية الخلية متقاربة بالكامل ، يتم وضع الإدخالات في وسائط النقل الموجودة في آبار جهاز PSEP. ثم تخضع الطبقة الأحادية للخلية لشكل موجي محدد من قبل المستخدم ، ويتم تأكيد كفاءة التوصيل من خلال الفحص المجهري الفلوري. يمكن تحسين سير العمل هذا بشكل كبير باستخدام قياسات TEEI بين الفحص المجهري النابض والفلوري لجمع بيانات إضافية حول عملية PSEP ، وترتبط بيانات TEEI الإضافية هذه بمقاييس التسليم مثل كفاءة التسليم والجدوى. توضح هذه المقالة بروتوكولا لإجراء PSEP مع قياسات TEEI.

Introduction

التثقيب الكهربائي هو تقنية تتعرض فيها الخلايا لمجال كهربائي ، مما يخلق مسام مؤقتة في غشاء الخلية يمكن من خلالها للشحنات ، بما في ذلك البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي ، تمرير ^1,2. الإصدار الأكثر استخداما هو التثقيب الكهربائي السائب (BEP). يتم تنفيذ أفضل الممارسات البيئية عن طريق ملء كوفيت بإلكتروليت يحتوي على ملايين الخلايا ، وتعريض المنحل بالكهرباء للجهد العالي ، والسماح للبضائع بدخول الخلايا من خلال الانتشار أو البطانة¹. هناك العديد من المزايا لأفضل الممارسات البيئية ، بما في ذلك الإنتاجية العالية والعديد من الأنظمة المتاحة تجاريا. ومع ذلك....

Protocol

يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة في جدول المواد.

1. إعداد الكواشف وزراعة الخلايا

1. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا عن طريق إضافة 50 مل من مصل الجنين البقري (FBS) و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين إلى حاوية سعة 500 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM). أنتج أحد عشر حصة سعة 50 مل لتقليل مخاطر التلوث وقم بالتبريد عند 4 درجات مئوية.
2. قم بإنشاء 1 مل من 25 ميكروغرام / مل من فبرونيكتين البلازما البشرية في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
3. قم بإنشاء 15 مل من يوديد البروبيديوم 0.1 مجم / مل في محلول مخزون ....

النتائج

يحدد البروتوكول المعطى طريقة لاستخدام قياسات TEEI لفحص العمليات الوسيطة للتثقيب الكهربائي وإجراء تنبؤات التسليم ، وتحديدا لخط خلية A431 وشحنة PI. وفي حين أن تعديل هذا البروتوكول يناقش بمزيد من التفصيل في المادة، فمن المهم أن نلاحظ الآن أنه في حين أن القيم المحددة قد تتغير، ف.......

Discussion

يوضح الشكل 2C أن زيادات TEEI من الحد الأدنى والانخفاضات من خط الأساس يتم رسمها لكل جهد شكل موجة PSEP. تخلق زيادة TEEI قوسا مكافئا ، يبلغ ذروته حوالي 20 فولت قبل التقليل ، بينما يزداد انخفاض TEEI من خط الأساس بشكل كبير مع زيادة الجهد. تعكس كفاءة التوصيل ونسب الوفيات ف?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046