Electroporación basada en sustrato poroso con monitoreo de impedancia eléctrica transepitelial

Resumen

La electroporación de sustratos porosos (PSEP) combina una entrega consistente y de alto rendimiento con una alta viabilidad de celda. La introducción de las mediciones de impedancia eléctrica transepitelial (TEEI) proporciona información sobre los procesos intermedios de PSEP y permite la entrega sin etiquetas. Este artículo discute un método para realizar experimentos de entrega de PSEP y análisis de medición TEEI simultáneamente.

Resumen

La electroporación de sustrato poroso (PSEP) es un método emergente de electroporación que proporciona un alto rendimiento y una entrega constante. Al igual que muchos otros tipos de administración intracelular, la PSEP depende en gran medida de los marcadores fluorescentes y la microscopía fluorescente para determinar el éxito de la administración. Para obtener información sobre los pasos intermedios del proceso de electroporación, se desarrolló una plataforma PSEP con monitoreo integrado de impedancia eléctrica transepitelial (TEEI). Las células se cultivan en insertos disponibles comercialmente con membranas porosas. Después de un período de incubación de 12 h para permitir la formación de una monocapa celular completamente confluente, los insertos se colocan en medios de transfección ubicados en los pocillos del dispositivo PSEP. A continuación, las monocapas celulares se someten a una forma de onda definida por el usuario y la eficiencia de la entrega se confirma mediante microscopía fluorescente. Este flujo de trabajo se puede mejorar significativamente con mediciones TEEI entre microscopía pulsante y fluorescente para recopilar datos adicionales sobre el proceso PSEP, y estos datos adicionales de TEEI se correlacionan con métricas de entrega, como la eficiencia y la viabilidad de la entrega. Este artículo describe un protocolo para realizar PSEP con mediciones TEEI.

Introducción

La electroporación es una técnica en la que las células se exponen a un campo eléctrico, creando poros temporales en la membrana celular a través de los cuales^{pueden pasar las} cargas, incluidas las proteínas, el ARN y el ADN. La versión más utilizada es la electroporación a granel (BEP). La BEP se realiza llenando una cubeta con un electrolito que contiene millones de células, exponiendo el electrolito a alto voltaje y permitiendo que la carga entre en las células a través de la difusión o^endocitosis. El BEP tiene muchas ventajas, como el alto rendimien....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de reactivos y cultivo celular

1. Prepare el medio de cultivo celular añadiendo 50 mL de suero fetal bovino (FBS) y 5 mL de penicilina-estreptomicina a un recipiente de 500 mL de Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM). Producir once alícuotas de 50 mL para reducir el riesgo de contaminación y refrigerar a 4 °C.
2. Cree 1 mL de 25 μg/mL de fibronectina plasmática humana en solución madre salina tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con las....

Discusión

La Figura 2C demuestra que los aumentos de TEEI desde el mínimo y las disminuciones desde la línea de base se trazan para cada voltaje de forma de onda PSEP. El aumento del TEEI crea un arco parabólico, que alcanza un máximo de alrededor de 20 voltios antes de reducirse, mientras que la disminución del TEEI desde la línea de base aumenta exponencialmente a medida que aumenta el voltaje. La eficiencia de entrega y los porcentajes de muerte en la

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046