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Die Elektroporation mit porösen Substraten (PSEP) kombiniert eine konsistente Abgabe mit hohem Durchsatz und einer hohen Zellviabilität. Die Einführung von transepithelialen elektrischen Impedanzmessungen (TEEI) gibt Einblick in die Zwischenprozesse von PSEP und ermöglicht eine markierungsfreie Verabreichung. In diesem Artikel wird eine Methode zur gleichzeitigen Durchführung von PSEP-Verabreichungsexperimenten und TEEI-Messanalysen erläutert.
Die Elektroporation poröser Substrate (PSEP) ist eine aufstrebende Methode der Elektroporation, die einen hohen Durchsatz und eine gleichmäßige Abgabe bietet. Wie viele andere Arten der intrazellulären Verabreichung stützt sich PSEP stark auf Fluoreszenzmarker und Fluoreszenzmikroskopie, um eine erfolgreiche Verabreichung zu bestimmen. Um einen Einblick in die Zwischenschritte des Elektroporationsprozesses zu erhalten, wurde eine PSEP-Plattform mit integrierter transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung (TEEI) entwickelt. Die Zellen werden in kommerziell erhältlichen Inserts mit porösen Membranen kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden, um die Bildung einer vollständig konfluenten Zellmonoschicht zu ermöglichen, werden die Inserts in Transfektionsmedien gelegt, die sich in den Vertiefungen des PSEP-Geräts befinden. Die Zellmonoschichten werden dann einer benutzerdefinierten Wellenform unterzogen, und die Abgabeeffizienz wird durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Dieser Arbeitsablauf kann mit TEEI-Messungen zwischen Puls- und Fluoreszenzmikroskopie erheblich verbessert werden, um zusätzliche Daten über den PSEP-Prozess zu sammeln, und diese zusätzlichen TEEI-Daten werden mit Verabreichungsmetriken wie Verabreichungseffizienz und Durchführbarkeit korreliert. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Durchführung von PSEP mit TEEI-Messungen beschrieben.
Die Elektroporation ist eine Technik, bei der Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wodurch temporäre Poren in der Zellmembran entstehen, durch die Frachten, einschließlich Proteine, RNA und DNA, gelangen können 1,2. Die am weitesten verbreitete Variante ist die Bulk-Elektroporation (BEP). Die BEP wird durchgeführt, indem eine Küvette mit einem Elektrolyten gefüllt wird, der Millionen von Zellen enthält, der Elektrolyt einer Hochspannung ausgesetzt wird und die Fracht durch Diffusion oder Endozytosein die Zellen gelangt 1. BEP bietet viele V....
Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Vorbereitung der Reagenzien und Zellkultur
Das vorliegende Protokoll etabliert eine Methode zur Verwendung von TEEI-Messungen, um die Zwischenprozesse der Elektroporation zu untersuchen und Vorhersagen über die Verabreichung zu treffen, insbesondere für die A431-Zelllinie und die PI-Fracht. Während die Modifikation dieses Protokolls in diesem Artikel weiter diskutiert wird, ist es wichtig zu beachten, dass sich die spezifischen Werte zwar ändern können, die allgemeinen Trends in der Reaktion jedoch konsistent bleiben. Zum Be.......
Abbildung 2C zeigt, dass TEEI-Anstiege von der Minimal- und die Abnahme gegenüber dem Ausgangswert für jede PSEP-Wellenformspannung aufgetragen werden. Die TEEI-Erhöhung erzeugt einen Parabolbogen, der einen Spitzenwert von etwa 20 Volt erreicht, bevor er abnimmt, während die TEEI-Abnahme gegenüber der Grundlinie mit steigender Spannung exponentiell ansteigt. Der Förderwirkungsgrad und der Todesprozentsatz in Abbildung 2D .......
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), die NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) und P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), die Nebraska Collaborative Initiative und die Voelte-Keegan Bioengineering Support. Das Gerät wurde in der NanoEngineering Research Core Facility (NERCF) hergestellt, die teilweise von der Nebraska Research Initiative finanziert wird.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 339651 | |
2-Chip Disposable Hemocytometer | Bulldog Bio | DHC-N01 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | fisherbrand | FB012937 | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3099 | |
Class II Type A2 Biosafety Cabinet | Labgard | NU-543-600 | |
Custom Components | YangLab | https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | fisherbrand | 05-539-6 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5670401 | |
Fluid Aspiration System | vacuubrand | 20727403 | |
HERACELL 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
Human Plasma Fibronectin | Sigma-Aldrich | FIBRP-RO | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | 491916-0001-000 | |
Inverted Microscope | Labomed | TCM 400 | |
PBS | cytiva | SH30256.02 | |
PCR Tube 200 µL | Sarstedt | 72.737 | |
Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
Pipette (0.2-2 µL) | fisherbrand Elite | FBE00002 | |
Pipette (100-1000 µL) | fisherbrand Elite | FBE01000 | |
Pipette (20-200 µL) | fisherbrand Elite | FBE00200 | |
Pipette (2-20 µL) | fisherbrand Elite | FBE00020 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Reaction Tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.300 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Thincert (24-well) | Greiner Bio-One | 662 641 | 0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET |
Tissue Culture Plate (24-well) | fisherbrand | FB012929 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154-20mL | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |
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