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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Die Elektroporation mit porösen Substraten (PSEP) kombiniert eine konsistente Abgabe mit hohem Durchsatz und einer hohen Zellviabilität. Die Einführung von transepithelialen elektrischen Impedanzmessungen (TEEI) gibt Einblick in die Zwischenprozesse von PSEP und ermöglicht eine markierungsfreie Verabreichung. In diesem Artikel wird eine Methode zur gleichzeitigen Durchführung von PSEP-Verabreichungsexperimenten und TEEI-Messanalysen erläutert.

Zusammenfassung

Die Elektroporation poröser Substrate (PSEP) ist eine aufstrebende Methode der Elektroporation, die einen hohen Durchsatz und eine gleichmäßige Abgabe bietet. Wie viele andere Arten der intrazellulären Verabreichung stützt sich PSEP stark auf Fluoreszenzmarker und Fluoreszenzmikroskopie, um eine erfolgreiche Verabreichung zu bestimmen. Um einen Einblick in die Zwischenschritte des Elektroporationsprozesses zu erhalten, wurde eine PSEP-Plattform mit integrierter transepithelialer elektrischer Impedanzüberwachung (TEEI) entwickelt. Die Zellen werden in kommerziell erhältlichen Inserts mit porösen Membranen kultiviert. Nach einer Inkubationszeit von 12 Stunden, um die Bildung einer vollständig konfluenten Zellmonoschicht zu ermöglichen, werden die Inserts in Transfektionsmedien gelegt, die sich in den Vertiefungen des PSEP-Geräts befinden. Die Zellmonoschichten werden dann einer benutzerdefinierten Wellenform unterzogen, und die Abgabeeffizienz wird durch Fluoreszenzmikroskopie bestätigt. Dieser Arbeitsablauf kann mit TEEI-Messungen zwischen Puls- und Fluoreszenzmikroskopie erheblich verbessert werden, um zusätzliche Daten über den PSEP-Prozess zu sammeln, und diese zusätzlichen TEEI-Daten werden mit Verabreichungsmetriken wie Verabreichungseffizienz und Durchführbarkeit korreliert. In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Durchführung von PSEP mit TEEI-Messungen beschrieben.

Einleitung

Die Elektroporation ist eine Technik, bei der Zellen einem elektrischen Feld ausgesetzt werden, wodurch temporäre Poren in der Zellmembran entstehen, durch die Frachten, einschließlich Proteine, RNA und DNA, gelangen können 1,2. Die am weitesten verbreitete Variante ist die Bulk-Elektroporation (BEP). Die BEP wird durchgeführt, indem eine Küvette mit einem Elektrolyten gefüllt wird, der Millionen von Zellen enthält, der Elektrolyt einer Hochspannung ausgesetzt wird und die Fracht durch Diffusion oder Endozytosein die Zellen gelangt 1. BEP bietet viele V....

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Zellkultur

  1. Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor, indem Sie 50 ml fötales Rinderserum (FBS) und 5 ml Penicillin-Streptomycin in einen 500-ml-Behälter mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) geben. Elf 50-ml-Aliquote herstellen, um das Kontaminationsrisiko zu verringern, und bei 4 °C kühlen.
  2. 1 ml Fibronektin im humanen Plasma mit 25 μg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gemäß den Anweisu....

Ergebnisse

Das vorliegende Protokoll etabliert eine Methode zur Verwendung von TEEI-Messungen, um die Zwischenprozesse der Elektroporation zu untersuchen und Vorhersagen über die Verabreichung zu treffen, insbesondere für die A431-Zelllinie und die PI-Fracht. Während die Modifikation dieses Protokolls in diesem Artikel weiter diskutiert wird, ist es wichtig zu beachten, dass sich die spezifischen Werte zwar ändern können, die allgemeinen Trends in der Reaktion jedoch konsistent bleiben. Zum Be.......

Diskussion

Abbildung 2C zeigt, dass TEEI-Anstiege von der Minimal- und die Abnahme gegenüber dem Ausgangswert für jede PSEP-Wellenformspannung aufgetragen werden. Die TEEI-Erhöhung erzeugt einen Parabolbogen, der einen Spitzenwert von etwa 20 Volt erreicht, bevor er abnimmt, während die TEEI-Abnahme gegenüber der Grundlinie mit steigender Spannung exponentiell ansteigt. Der Förderwirkungsgrad und der Todesprozentsatz in Abbildung 2D .......

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Danksagungen

Wir danken für die finanzielle Unterstützung durch die NSF (Awards 1826135, 1936065, 2143997), die NIH National Institutes of General Medical Sciences P20GM113126 (Nebraska Center for Integrated Biomolecular Communication) und P30GM127200 (Nebraska Center for Nanomedicine), die Nebraska Collaborative Initiative und die Voelte-Keegan Bioengineering Support. Das Gerät wurde in der NanoEngineering Research Core Facility (NERCF) hergestellt, die teilweise von der Nebraska Research Initiative finanziert wird.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Centrifuge TubeThermo Scientific339651
2-Chip Disposable HemocytometerBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Tissue Culture FlaskfisherbrandFB012937
A431 CellsATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Class II Type A2 Biosafety CabinetLabgardNU-543-600
Custom ComponentsYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibcoA5670401
Fluid Aspiration Systemvacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Human Plasma FibronectinSigma-AldrichFIBRP-RO
Inverted Fluorescent MicroscopeZeiss491916-0001-000
Inverted MicroscopeLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR Tube 200 µLSarstedt72.737
Penicillin / StreptomycinGibco15140148
Pipette (0.2-2 µL)fisherbrand EliteFBE00002
Pipette (100-1000 µL)fisherbrand EliteFBE01000
Pipette (20-200 µL)fisherbrand EliteFBE00200
Pipette (2-20 µL)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
Reaction Tube 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

Referenzen

  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917 (2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intrac....

Nachdrucke und Genehmigungen

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