A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) משלבת אספקה עקבית בתפוקה גבוהה עם כדאיות תאים גבוהה. הכנסת מדידות עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI) מספקת תובנה לגבי תהליכי הביניים של PSEP ומאפשרת אספקה ללא תוויות. מאמר זה דן בשיטה לביצוע ניסויי העברת PSEP וניתוח מדידת TEEI בו-זמנית.
אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) היא שיטה מתפתחת של אלקטרופורציה המספקת תפוקה גבוהה ואספקה עקבית. כמו סוגים רבים אחרים של אספקה תוך-תאית, PSEP מסתמך במידה רבה על סמנים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע מסירה מוצלחת. כדי לקבל תובנה לגבי שלבי הביניים של תהליך האלקטרופורציה, פותחה פלטפורמת PSEP עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל משולב (TEEI). התאים מגודלים בתרבית בתוספות מסחריות עם ממברנות נקבוביות. לאחר תקופת דגירה של 12 שעות כדי לאפשר היווצרות של חד-שכבה תאית מתמזגת במלואה, התוספות ממוקמות באמצעי טרנספקציה הממוקמים בבארות של מכשיר PSEP. לאחר מכן חד-שכבות התא נחשפות לצורת גל המוגדרת על-ידי המשתמש, ויעילות המסירה מאושרת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לשפר זרימת עבודה זו באופן משמעותי באמצעות מדידות TEEI בין מיקרוסקופ פועם למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאסוף נתונים נוספים על תהליך PSEP, ונתוני TEEI נוספים אלה מתואמים עם מדדי מסירה כגון יעילות מסירה וכדאיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע PSEP עם מדידות TEEI.
אלקטרופורציה היא טכניקה שבה תאים נחשפים לשדה חשמלי, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום התא שדרכן מטענים, כולל חלבונים, רנ"א ודנ"א, יכולים לעבור 1,2. הגרסה הנפוצה ביותר היא אלקטרופורציה בתפזורת (BEP). BEP מבוצע על ידי מילוי קובטה באלקטרוליט המכיל מיליוני תאים, חושף את האלקטרוליט למתח גבוה, ומאפשר למטען להיכנס לתאים באמצעות דיפוזיה או אנדוציטוזה1. ישנם יתרונות רבים ל- BEP, כולל תפוקה גבוהה ומערכות רבות הזמינות מסחרית. עם זאת, ישנן מגבלות למשלוח ה- BEP. מיקום תאים לא עקבי ביחס לאלקטרודות ומיגון שדה חשמלי מתאים סמוכים גורם לשונות משמעותית בחשיפה לשדה חשמלי במהלך....
פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת ריאגנטים ותרבית תאים
הפרוטוקול הנתון קובע שיטה לשימוש במדידות TEEI כדי לבחון את תהליכי הביניים של אלקטרופורציה ולבצע תחזיות מסירה, במיוחד עבור קו תאי A431 ומטען PI. בעוד שינוי פרוטוקול זה נדון בהמשך המאמר, חשוב לציין כעת כי בעוד הערכים הספציפיים עשויים להשתנות, מגמות כלליות בתגובה נשארות עקביות. .......
איור 2C מדגים כי TEEI עולה ממינימום ויורד מקו הבסיס מתוות עבור כל מתח בצורת גל PSEP. עליית TEEI יוצרת קשת פרבולית, שמגיעה לשיא סביב 20 וולט לפני הפחתה, בעוד שהירידה של TEEI מקו הבסיס עולה באופן אקספוננציאלי ככל שהמתח עולה. יעילות המסירה ואחוזי המוות באיור.......
המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.
אנו מכירים בתמיכת המימון של NSF (פרסים 1826135, 1936065, 2143997), המכונים הלאומיים של NIH למדעי הרפואה הכלליים P20GM113126 (מרכז נברסקה לתקשורת ביומולקולרית משולבת) ו- P30GM127200 (מרכז נברסקה לננו-רפואה), יוזמת שיתוף הפעולה של נברסקה והתמיכה הביו-הנדסית של Voelte-Keegan. המכשיר יוצר במתקן ליבת המחקר של ננו-הנדסה (NERCF), הממומן חלקית על ידי יוזמת המחקר של נברסקה.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
15 mL Conical Centrifuge Tube | Thermo Scientific | 339651 | |
2-Chip Disposable Hemocytometer | Bulldog Bio | DHC-N01 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | fisherbrand | FB012937 | |
A431 Cells | ATCC | CRL-1555 | |
Calcein AM | Invitrogen | C3099 | |
Class II Type A2 Biosafety Cabinet | Labgard | NU-543-600 | |
Custom Components | YangLab | https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI | |
Disposable Centrifuge Tube (50 mL) | fisherbrand | 05-539-6 | |
DMEM | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5670401 | |
Fluid Aspiration System | vacuubrand | 20727403 | |
HERACELL 240i | Thermo Scientific | 51026331 | |
Hoechst 33342 | Thermo Scientific | 62249 | |
Human Plasma Fibronectin | Sigma-Aldrich | FIBRP-RO | |
Inverted Fluorescent Microscope | Zeiss | 491916-0001-000 | |
Inverted Microscope | Labomed | TCM 400 | |
PBS | cytiva | SH30256.02 | |
PCR Tube 200 µL | Sarstedt | 72.737 | |
Penicillin / Streptomycin | Gibco | 15140148 | |
Pipette (0.2-2 µL) | fisherbrand Elite | FBE00002 | |
Pipette (100-1000 µL) | fisherbrand Elite | FBE01000 | |
Pipette (20-200 µL) | fisherbrand Elite | FBE00200 | |
Pipette (2-20 µL) | fisherbrand Elite | FBE00020 | |
Propidium Iodide | Invitrogen | P1304MP | |
Reaction Tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.690.300 | |
Sorvall ST 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
Thincert (24-well) | Greiner Bio-One | 662 641 | 0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET |
Tissue Culture Plate (24-well) | fisherbrand | FB012929 | |
Trypan Blue Solution | Sigma-Aldrich | T8154-20mL | |
Trypsin | Gibco | 15090046 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved