A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) משלבת אספקה עקבית בתפוקה גבוהה עם כדאיות תאים גבוהה. הכנסת מדידות עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI) מספקת תובנה לגבי תהליכי הביניים של PSEP ומאפשרת אספקה ללא תוויות. מאמר זה דן בשיטה לביצוע ניסויי העברת PSEP וניתוח מדידת TEEI בו-זמנית.

Abstract

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) היא שיטה מתפתחת של אלקטרופורציה המספקת תפוקה גבוהה ואספקה עקבית. כמו סוגים רבים אחרים של אספקה תוך-תאית, PSEP מסתמך במידה רבה על סמנים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע מסירה מוצלחת. כדי לקבל תובנה לגבי שלבי הביניים של תהליך האלקטרופורציה, פותחה פלטפורמת PSEP עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל משולב (TEEI). התאים מגודלים בתרבית בתוספות מסחריות עם ממברנות נקבוביות. לאחר תקופת דגירה של 12 שעות כדי לאפשר היווצרות של חד-שכבה תאית מתמזגת במלואה, התוספות ממוקמות באמצעי טרנספקציה הממוקמים בבארות של מכשיר PSEP. לאחר מכן חד-שכבות התא נחשפות לצורת גל המוגדרת על-ידי המשתמש, ויעילות המסירה מאושרת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לשפר זרימת עבודה זו באופן משמעותי באמצעות מדידות TEEI בין מיקרוסקופ פועם למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאסוף נתונים נוספים על תהליך PSEP, ונתוני TEEI נוספים אלה מתואמים עם מדדי מסירה כגון יעילות מסירה וכדאיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע PSEP עם מדידות TEEI.

Introduction

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה תאים נחשפים לשדה חשמלי, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום התא שדרכן מטענים, כולל חלבונים, רנ"א ודנ"א, יכולים לעבור 1,2. הגרסה הנפוצה ביותר היא אלקטרופורציה בתפזורת (BEP). BEP מבוצע על ידי מילוי קובטה באלקטרוליט המכיל מיליוני תאים, חושף את האלקטרוליט למתח גבוה, ומאפשר למטען להיכנס לתאים באמצעות דיפוזיה או אנדוציטוזה1. ישנם יתרונות רבים ל- BEP, כולל תפוקה גבוהה ומערכות רבות הזמינות מסחרית. עם זאת, ישנן מגבלות למשלוח ה- BEP. מיקום תאים לא עקבי ביחס לאלקטרודות ומיגון שדה חשמלי מתאים סמוכים גורם לשונות משמעותית בחשיפה לשדה חשמלי במהלך....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים ותרבית תאים

  1. הכינו את מדיית תרבית התאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין למיכל של 500 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM). לייצר אחד עשר 50 מ"ל aliquots כדי להפחית את הסיכון של זיהום ומקרר ב 4 °C.
  2. צור 1 מ"ל של 25 מיקרוגרם/מ"ל פלסמה אנושית פיברונקטין בתמיסת מלאי של מלח חוצץ פוספט (PBS) בהתאם להוראות היצרן.
  3. צור 15 מ"ל של 0.1 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד בתמיסת מלאי DMEM כדי לאפשר ניסויים עם ריכוזי מטען משתנים.
  4. תרבית תאי A431....

תוצאות

הפרוטוקול הנתון קובע שיטה לשימוש במדידות TEEI כדי לבחון את תהליכי הביניים של אלקטרופורציה ולבצע תחזיות מסירה, במיוחד עבור קו תאי A431 ומטען PI. בעוד שינוי פרוטוקול זה נדון בהמשך המאמר, חשוב לציין כעת כי בעוד הערכים הספציפיים עשויים להשתנות, מגמות כלליות בתגובה נשארות עקביות. .......

Discussion

איור 2C מדגים כי TEEI עולה ממינימום ויורד מקו הבסיס מתוות עבור כל מתח בצורת גל PSEP. עליית TEEI יוצרת קשת פרבולית, שמגיעה לשיא סביב 20 וולט לפני הפחתה, בעוד שהירידה של TEEI מקו הבסיס עולה באופן אקספוננציאלי ככל שהמתח עולה. יעילות המסירה ואחוזי המוות באיור.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

אנו מכירים בתמיכת המימון של NSF (פרסים 1826135, 1936065, 2143997), המכונים הלאומיים של NIH למדעי הרפואה הכלליים P20GM113126 (מרכז נברסקה לתקשורת ביומולקולרית משולבת) ו- P30GM127200 (מרכז נברסקה לננו-רפואה), יוזמת שיתוף הפעולה של נברסקה והתמיכה הביו-הנדסית של Voelte-Keegan. המכשיר יוצר במתקן ליבת המחקר של ננו-הנדסה (NERCF), הממומן חלקית על ידי יוזמת המחקר של נברסקה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL Conical Centrifuge TubeThermo Scientific339651
2-Chip Disposable HemocytometerBulldog BioDHC-N01
75 cm2 Tissue Culture FlaskfisherbrandFB012937
A431 CellsATCCCRL-1555
Calcein AMInvitrogenC3099
Class II Type A2 Biosafety CabinetLabgardNU-543-600
Custom ComponentsYangLabhttps://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)fisherbrand05-539-6
DMEMGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibcoA5670401
Fluid Aspiration Systemvacuubrand20727403
HERACELL 240iThermo Scientific51026331
Hoechst 33342Thermo Scientific62249
Human Plasma FibronectinSigma-AldrichFIBRP-RO
Inverted Fluorescent MicroscopeZeiss491916-0001-000
Inverted MicroscopeLabomedTCM 400
PBScytivaSH30256.02
PCR Tube 200 µLSarstedt72.737
Penicillin / StreptomycinGibco15140148
Pipette (0.2-2 µL)fisherbrand EliteFBE00002
Pipette (100-1000 µL)fisherbrand EliteFBE01000
Pipette (20-200 µL)fisherbrand EliteFBE00200
Pipette (2-20 µL)fisherbrand EliteFBE00020
Propidium IodideInvitrogenP1304MP
Reaction Tube 1.5 mLSarstedt72.690.300
Sorvall ST 16R CentrifugeThermo Scientific75004240
Thincert (24-well)Greiner Bio-One662 6410.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)fisherbrandFB012929
Trypan Blue SolutionSigma-AldrichT8154-20mL
TrypsinGibco15090046

References

  1. Brooks, J., et al. High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery. Small. 16 (51), e2004917 (2020).
  2. Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. Intrac....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved