אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

Summary

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) משלבת אספקה עקבית בתפוקה גבוהה עם כדאיות תאים גבוהה. הכנסת מדידות עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI) מספקת תובנה לגבי תהליכי הביניים של PSEP ומאפשרת אספקה ללא תוויות. מאמר זה דן בשיטה לביצוע ניסויי העברת PSEP וניתוח מדידת TEEI בו-זמנית.

Abstract

אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP) היא שיטה מתפתחת של אלקטרופורציה המספקת תפוקה גבוהה ואספקה עקבית. כמו סוגים רבים אחרים של אספקה תוך-תאית, PSEP מסתמך במידה רבה על סמנים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע מסירה מוצלחת. כדי לקבל תובנה לגבי שלבי הביניים של תהליך האלקטרופורציה, פותחה פלטפורמת PSEP עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל משולב (TEEI). התאים מגודלים בתרבית בתוספות מסחריות עם ממברנות נקבוביות. לאחר תקופת דגירה של 12 שעות כדי לאפשר היווצרות של חד-שכבה תאית מתמזגת במלואה, התוספות ממוקמות באמצעי טרנספקציה הממוקמים בבארות של מכשיר PSEP. לאחר מכן חד-שכבות התא נחשפות לצורת גל המוגדרת על-ידי המשתמש, ויעילות המסירה מאושרת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לשפר זרימת עבודה זו באופן משמעותי באמצעות מדידות TEEI בין מיקרוסקופ פועם למיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאסוף נתונים נוספים על תהליך PSEP, ונתוני TEEI נוספים אלה מתואמים עם מדדי מסירה כגון יעילות מסירה וכדאיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול לביצוע PSEP עם מדידות TEEI.

Introduction

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה תאים נחשפים לשדה חשמלי, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום התא שדרכן מטענים, כולל חלבונים, רנ"א ודנ"א, יכולים לעבור ^1,2. הגרסה הנפוצה ביותר היא אלקטרופורציה בתפזורת (BEP). BEP מבוצע על ידי מילוי קובטה באלקטרוליט המכיל מיליוני תאים, חושף את האלקטרוליט למתח גבוה, ומאפשר למטען להיכנס לתאים באמצעות דיפוזיה או אנדוציטוזה¹. ישנם יתרונות רבים ל- BEP, כולל תפוקה גבוהה ומערכות רבות הזמינות מסחרית. עם זאת, ישנן מגבלות למשלוח ה- BEP. מיקום תאים לא עקבי ביחס לאלקטרודות ומיגון שדה חשמלי מתאים סמוכים גורם לשונות משמעותית בחשיפה לשדה חשמלי במהלך....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת ריאגנטים ותרבית תאים

1. הכינו את מדיית תרבית התאים על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS) ו-5 מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין למיכל של 500 מ"ל של מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM). לייצר אחד עשר 50 מ"ל aliquots כדי להפחית את הסיכון של זיהום ומקרר ב 4 °C.
2. צור 1 מ"ל של 25 מיקרוגרם/מ"ל פלסמה אנושית פיברונקטין בתמיסת מלאי של מלח חוצץ פוספט (PBS) בהתאם להוראות היצרן.
3. צור 15 מ"ל של 0.1 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד בתמיסת מלאי DMEM כדי לאפשר ניסויים עם ריכוזי מטען משתנים.
4. תרבית תאי A431....

תוצאות

הפרוטוקול הנתון קובע שיטה לשימוש במדידות TEEI כדי לבחון את תהליכי הביניים של אלקטרופורציה ולבצע תחזיות מסירה, במיוחד עבור קו תאי A431 ומטען PI. בעוד שינוי פרוטוקול זה נדון בהמשך המאמר, חשוב לציין כעת כי בעוד הערכים הספציפיים עשויים להשתנות, מגמות כלליות בתגובה נשארות עקביות. .......

Discussion

איור 2C מדגים כי TEEI עולה ממינימום ויורד מקו הבסיס מתוות עבור כל מתח בצורת גל PSEP. עליית TEEI יוצרת קשת פרבולית, שמגיעה לשיא סביב 20 וולט לפני הפחתה, בעוד שהירידה של TEEI מקו הבסיס עולה באופן אקספוננציאלי ככל שהמתח עולה. יעילות המסירה ואחוזי המוות באיור.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046