Электропорация на основе пористой подложки с трансэпителиальным электроимпедансным мониторингом

Резюме

Электропористая субстрата (PSEP) сочетает в себе стабильную высокую производительность с высокой жизнеспособностью ячеек. Введение измерений трансэпителиального электрического импеданса (TEEI) дает представление о промежуточных процессах PSEP и позволяет доставлять продукцию без меток. В данной статье рассматривается метод одновременного проведения экспериментов по доставке PSEP и анализа измерений TEEI.

Аннотация

Электропористая субстрата (PSEP) — это новый метод электропорации, который обеспечивает высокую производительность и стабильную подачу. Как и многие другие типы внутриклеточной доставки, PSEP в значительной степени полагается на флуоресцентные маркеры и флуоресцентную микроскопию для определения успешной доставки. Чтобы получить представление о промежуточных этапах процесса электропорации, была разработана платформа PSEP со встроенным мониторингом трансэпителиального электрического импеданса (TEEI). Клетки культивируются в коммерчески доступных вставках с пористыми мембранами. После 12-часового инкубационного периода для образования полностью сливающегося клеточного монослоя вкладыши помещают в трансфекционные среды, расположенные в лунках устройства PSEP. Затем монослои клеток подвергаются воздействию заданной пользователем формы сигнала, а эффективность доставки подтверждается с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот рабочий процесс может быть значительно улучшен с помощью измерений TEEI между импульсной и флуоресцентной микроскопией для сбора дополнительных данных о процессе PSEP, и эти дополнительные данные TEEI коррелируют с такими показателями доставки, как эффективность и жизнеспособность доставки. В данной статье описан протокол проведения PSEP с измерениями TEEI.

Введение

Электропорация — это метод, при котором клетки подвергаются воздействию электрического поля, создавая временные поры в клеточной мембране, через которые ^{могут проходить} грузы, включая белки, РНК и ДНК. Наиболее широко используемым вариантом является объемная электропорация (BEP). BEP выполняется путем заполнения кюветы электролитом, содержащим миллионы клеток, подвергая электролит воздействию высокого напряжения и позволяя грузу проникать в клетки посредством диффузии или эндоцитоза^. У BEP есть много преимуществ, в том числе высокая пропускная способнос....

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка реагентов и клеточной культуры

1. Приготовьте питательную среду для клеточных культур, добавив 50 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 5 мл пенициллин-стрептомицина в контейнер объемом 500 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) от Dulbecco. Изготовьте одиннадцать аликвот по 50 мл для снижения риска загрязнения и храните в холодильнике при температуре 4 °C.
2. Создайте 1 мл фибронектина плазмы крови человека 25 мкг/мл в исходном раств....

Результаты

Данный протокол устанавливает метод использования измерений TEEI для изучения промежуточных процессов электропорации и прогнозирования доставки, в частности, для клеточной линии A431 и груза PI. Хотя модификация этого протокола обсуждается далее в статье, важно отметит?.......

Обсуждение

На рисунке 2C показано, что для каждого напряжения сигнала PSEP построены графики увеличения TEEI от минимума и уменьшения от базового уровня. Увеличение TEEI создает параболическую дугу, достигающую пика около 20 вольт перед снижением, в то время как уменьше?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046