Transepitelyal Elektriksel Empedans İzleme ile Gözenekli Substrat Bazlı Elektroporasyon

Özet

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), tutarlı, yüksek verimli iletimi yüksek hücre canlılığı ile eşleştirir. Transepitelyal elektrik empedans (TEEI) ölçümlerinin tanıtılması, PSEP'in ara süreçleri hakkında bilgi sağlar ve etiketsiz teslimata olanak tanır. Bu makalede, PSEP dağıtım deneylerini ve TEEI ölçüm analizini aynı anda gerçekleştirmek için bir yöntem tartışılmaktadır.

Özet

Gözenekli substrat elektroporasyonu (PSEP), yüksek verim ve tutarlı teslimat sağlayan yeni ortaya çıkan bir elektroporasyon yöntemidir. Diğer birçok hücre içi doğum türü gibi, PSEP de başarılı doğumu belirlemek için büyük ölçüde floresan belirteçlere ve floresan mikroskobuna dayanır. Elektroporasyon işleminin ara adımları hakkında bilgi edinmek için, entegre transepitelyal elektriksel empedans (TEEI) izlemeye sahip bir PSEP platformu geliştirilmiştir. Hücreler, gözenekli zarlara sahip ticari olarak temin edilebilen eklerde kültürlenir. 12 saatlik bir inkübasyon süresinden sonra, tamamen birleşik bir hücre tek tabakasının oluşumuna izin vermek için, ekler PSEP cihazının kuyucuklarında bulunan transfeksiyon ortamına yerleştirilir. Hücre tek katmanları daha sonra kullanıcı tanımlı bir dalga formuna tabi tutulur ve dağıtım verimliliği floresan mikroskobu ile doğrulanır. Bu iş akışı, PSEP süreci hakkında ek veri toplamak için darbeli ve floresan mikroskobu arasındaki TEEI ölçümleriyle önemli ölçüde geliştirilebilir ve bu ek TEEI verileri, teslimat verimliliği ve uygulanabilirliği gibi teslimat ölçümleriyle ilişkilendirilir. Bu makalede, TEEI ölçümleriyle PSEP gerçekleştirmek için bir protokol açıklanmaktadır.

Giriş

Elektroporasyon, hücrelerin bir elektrik alanına maruz bırakıldığı, hücre zarında proteinler, RNA ve DNA dahil olmak üzere kargoların^{geçebileceği} geçici gözenekler oluşturduğu bir tekniktir ^1,2. En yaygın kullanılan versiyon toplu elektroporasyondur (BEP). BEP, bir küvetin milyonlarca hücre içeren bir elektrolit ile doldurulması, elektrolitin yüksek voltaja maruz bırakılması ve yükün difüzyon veya endositoz¹ yoluyla hücrelere girmesine izin verilmesiyle gerçekleştirilir. BEP'in yüksek verim ve ticari olarak temin edilebilen çok sayıda sistem dahil olmak....

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Reaktiflerin ve hücre kültürünün hazırlanması

1. 500 mL'lik bir Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kabına 50 mL fetal sığır serumu (FBS) ve 5 mL penisilin-streptomisin ekleyerek hücre kültürü ortamını hazırlayın. Kontaminasyon riskini azaltmak için on bir adet 50 mL'lik alikot üretin ve 4 °C'de soğutun.
2. Üreticinin talimatlarına göre fosfat tamponlu salin (PBS) stok çözeltisinde 1 mL 25 μg / mL insan plazma fibronektini oluşturun.
3. Değişen kargo....

Tartışmalar

Şekil 2C , her bir PSEP dalga biçimi voltajı için TEEI'nin minimumdan artışlarının ve taban çizgisinden düşüşlerin çizildiğini göstermektedir. TEEI artışı, azalmadan önce yaklaşık 20 volt zirve yapan parabolik bir ark oluştururken, taban çizgisinden TEEI düşüşü, voltaj arttıkça katlanarak artar. Şekil 2D'deki teslimat verimliliği ve ölüm yüzdeleri, teslimat verimliliği parabolik olarak ark ya.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046