Électroporation à base de substrat poreux avec surveillance de l’impédance électrique transépithéliale

Résumé

L’électroporation de substrat poreux (PSEP) associe une distribution constante et à haut débit à une viabilité élevée des cellules. L’introduction de mesures d’impédance électrique transépithéliale (TEEI) donne un aperçu des processus intermédiaires du PSEP et permet une administration sans étiquette. Cet article traite d’une méthode permettant d’effectuer simultanément des expériences d’administration PSEP et une analyse de mesure TEEI.

Résumé

L’électroporation sur substrat poreux (PSEP) est une méthode émergente d’électroporation qui offre un débit élevé et une livraison constante. Comme de nombreux autres types d’administration intracellulaire, le PSEP s’appuie fortement sur des marqueurs fluorescents et la microscopie fluorescente pour déterminer la réussite de l’administration. Pour mieux comprendre les étapes intermédiaires du processus d’électroporation, une plateforme PSEP avec surveillance intégrée de l’impédance électrique transépithéliale (TEEI) a été développée. Les cellules sont cultivées dans des inserts disponibles dans le commerce avec des membranes poreuses. Après une période d’incubation de 12 h pour permettre la formation d’une monocouche cellulaire entièrement confluente, les inserts sont placés dans un milieu de transfection situé dans les puits du dispositif PSEP. Les monocouches cellulaires sont ensuite soumises à une forme d’onde définie par l’utilisateur, et l’efficacité de distribution est confirmée par la microscopie fluorescente. Ce flux de travail peut être considérablement amélioré grâce à des mesures TEEI entre la microscopie pulsée et la microscopie fluorescente pour collecter des données supplémentaires sur le processus PSEP, et ces données TEEI supplémentaires sont corrélées avec des paramètres de livraison tels que l’efficacité et la viabilité de la livraison. Cet article décrit un protocole permettant d’effectuer des mesures PSEP avec TEEI.

Introduction

L’électroporation est une technique dans laquelle les cellules sont exposées à un champ électrique, créant des pores temporaires dans la membrane cellulaire à travers lesquels les marchandises, y compris les protéines, l’ARN et l’ADN, peuvent passer ^1,2. La version la plus utilisée est l’électroporation en vrac (BEP). La PEB est réalisée en remplissant une cuvette avec un électrolyte contenant des millions de cellules, en exposant l’électrolyte à une haute tension et en permettant à la cargaison de pénétrer dans les cellules par diffusion ou endocytose¹....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation des réactifs et culture cellulaire

1. Préparez le milieu de culture cellulaire en ajoutant 50 ml de sérum fœtal bovin (FBS) et 5 ml de pénicilline-streptomycine dans un contenant de 500 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM). Produire onze aliquotes de 50 mL pour réduire le risque de contamination et réfrigérer à 4 °C.
2. Créer 1 mL de 25 μg/mL de fibronectine plasmatique humaine dans une solution mère de solution saline tamponnée ....

Discussion

La figure 2C montre que les augmentations par rapport au minimum et les diminutions par rapport à la ligne de base sont tracées pour chaque tension de forme d’onde PSEP. L’augmentation TEEI crée un arc parabolique, culminant autour de 20 volts avant de diminuer, tandis que la diminution TEEI par rapport à la ligne de base augmente de manière exponentielle à mesure que la tension augmente. L’efficacité de la distribution et les pourcentages de mo.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL Conical Centrifuge Tube	Thermo Scientific	339651
2-Chip Disposable Hemocytometer	Bulldog Bio	DHC-N01
75 cm2 Tissue Culture Flask	fisherbrand	FB012937
A431 Cells	ATCC	CRL-1555
Calcein AM	Invitrogen	C3099
Class II Type A2 Biosafety Cabinet	Labgard	NU-543-600
Custom Components	YangLab		https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI
Disposable Centrifuge Tube (50 mL)	fisherbrand	05-539-6
DMEM	Gibco	11965092
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5670401
Fluid Aspiration System	vacuubrand	20727403
HERACELL 240i	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Thermo Scientific	62249
Human Plasma Fibronectin	Sigma-Aldrich	FIBRP-RO
Inverted Fluorescent Microscope	Zeiss	491916-0001-000
Inverted Microscope	Labomed	TCM 400
PBS	cytiva	SH30256.02
PCR Tube 200 µL	Sarstedt	72.737
Penicillin / Streptomycin	Gibco	15140148
Pipette (0.2-2 µL)	fisherbrand Elite	FBE00002
Pipette (100-1000 µL)	fisherbrand Elite	FBE01000
Pipette (20-200 µL)	fisherbrand Elite	FBE00200
Pipette (2-20 µL)	fisherbrand Elite	FBE00020
Propidium Iodide	Invitrogen	P1304MP
Reaction Tube 1.5 mL	Sarstedt	72.690.300
Sorvall ST 16R Centrifuge	Thermo Scientific	75004240
Thincert (24-well)	Greiner Bio-One	662 641	0.4 µm pore diameter, 2x106 cm-2 pore density, transparent PET
Tissue Culture Plate (24-well)	fisherbrand	FB012929
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154-20mL
Trypsin	Gibco	15090046