الكشف الفعال عن الخلايا السكانية الجانبية Hoechst عن طريق قياس التدفق الخلوي

Summary

هنا ، نظهر أن الليزر عالي الطاقة 375 نانومتر و 405 نانومتر يمكن أن يثير بشكل فعال Hoechst 33342 ويعمل كبديل قابل للتطبيق لليزر 355 نانومتر لاكتشاف خلايا السكان الجانبية (SP) ، وبالتالي توسيع نطاق الليزر المتاح في تطبيقات قياس التدفق الخلوي.

Abstract

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). يتم استخدام طريقة Hoechst SP لعزل الخلايا الجذعية بناء على خصائص تدفق الصبغة لناقلات الكاسيت المرتبطة ب ATP (ABC). تم استخدام هذه الطريقة في البداية لتحديد وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، لكنها تطورت الآن للتركيز بشكل أساسي على تحديد وعزل الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs). تستخدم طريقة الكشف التقليدية ل FCM ليزر 355 نانومتر لإثارة الصبغة للكشف عن خلايا SP. من خلال هذه الدراسة ، نجحنا في تحديد طرق بديلة لإثارة الصبغة التي يمكن أن تحل محل اكتشاف خلايا SP بشكل فعال باستخدام ليزر 355 نانومتر. يتم تحقيق ذلك من خلال استخدام ليزر 375 نانومتر أو 405 نانومتر عالي الطاقة. هذا يسمح لنا بممارسة انتقائية معززة في الكشف عن خلايا SP بدلا من أن تقتصر فقط على قياس التدفق الخلوي بالليزر 355 نانومتر.

Introduction

يتم تحديد خلايا السكان الجانبية (SP) من خلال تلطيخ Hoechst 33342 وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (FCM). تتميز خلايا SP بضخ صبغة الحمض النووي الفلورية خارج الخلايا من خلال ناقل الكاسيت المرتبط ب ATP (ABC) ^1,2. تم إنشاء هذه الطريقة في الأصل لعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع عظم الفئران (HSCs) ¹. تم إثراء خلايا نخاع العظم SP بمجموعة من HSCs تتميز^{بتعبير منخفض} CD117 ⁺ Sca-1 ^{+ Lin-Thy1 3,4}. بعد ذلك ، تم استخدام الطريقة على نطاق واسع لعزل وإثراء الخلايا الجذعية من الأنسجة الأخرى ....

Protocol

استخدمت التجارب في هذه الدراسة ما مجموعه 10 فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 8 و 12 أسبوعا. أجريت العمليات التجريبية وفقا لبروتوكول تمت الموافقة عليه من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام بجامعة سيتشوان (# 201609309). يتم سرد المواد التجريبية ومعلمات قياس التدفق الخلوي المستخدمة في هذه المقالة في جدول المواد.

1. عزل وجمع خلايا نخاع عظم الفأر

1. القتل الرحيم للفئران بما يتفق بدقة مع المبادئ التوجيهية المؤسسية. للحث على فقدان الوعي في الفأر ، يتم تطبيق التخدير بالاستنشاق بدءا من 2٪ إيزوفلوران ، تليها زيادة تدريجية في الجرعة إلى 5٪ إيزوفلوران حتى توقف التنفس.
2. تشريح الفئران في الجناح الجراحي....

النتائج

في الشكل 2 ، عولجت المجموعة الضابطة بالفيراباميل ، الذي يمنع ناقلات ABC في الخلايا الجذعية لمنع التخلص من Hoechst 33342. وبالتالي ، فإن الخلايا الجذعية في المجموعة غير فيراباميل تطرد Hoechst 33342 وتشكل مجموعة خلايا سالبة تعرف باسم خلايا SP. أثار ليزر 355 نانومتر صبغة Hoechst 33342 بشكل فعال ، مم.......

Discussion

استخدمنا البروتوكول الموصوف لإجراء ثلاث تجارب ، كل تجربة شملت 3-4 فئران ، مما أدى إلى ما مجموعه 10 فئران. تراوحت نسبة خلايا SP من 0.05٪ إلى 0.76٪. من المهم أن نلاحظ أنه لوحظت اختلافات فردية بين الفئران. استخدمنا أربعة مقاييس للتدفق الخلوي لتحليل عينات Hoechst. لوحظ أن إثارة صبغة Hoechst بواسطة ليزر 20 mW 355 nm.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629