Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Özet

Burada, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyarabileceğini ve yan popülasyon (SP) hücre tespiti için 355 nm lazere uygun bir alternatif olarak hizmet edebileceğini ve böylece akış sitometrisi uygulamalarında mevcut lazer yelpazesini genişletebileceğini gösteriyoruz.

Özet

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. Hoechst SP yöntemi, ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcılarının boya akış özelliklerine dayalı olarak kök hücrelerin izolasyonu için kullanılır. Yöntem başlangıçta hematopoetik kök hücrelerin (HSC'ler) tanımlanması ve izolasyonu için kullanıldı, ancak şimdi öncelikle kanser kök hücrelerinin (CSC'ler) tanımlanması ve izolasyonuna odaklanmak için gelişti. FCM'nin geleneksel algılama yöntemi, SP hücrelerini tespit etmek için boyayı uyarmak için 355 nm'lik bir lazer kullanır. Bu çalışma sayesinde, 355 nm lazer kullanarak SP hücrelerinin tespitinin yerini alabilecek boya uyarımı için alternatif yaklaşımları başarıyla belirledik. Bu, yüksek güçlü 375 nm veya 405 nm lazerlerin kullanılmasıyla elde edilir. Bu, yalnızca 355 nm lazer akış sitometrisi ile sınırlı kalmak yerine, SP hücrelerinin tespitinde gelişmiş seçicilik uygulamamıza izin verir.

Giriş

Yan popülasyon (SP) hücreleri, Hoechst 33342 boyama ile tanımlanır ve akış sitometrisi (FCM) kullanılarak analiz edilir. SP hücreleri, floresan DNA boyasının ATP bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları ^1,2 aracılığıyla hücrelerden dışarı pompalanması ile karakterize edilir. Yöntem başlangıçta murin kemik iliği hematopoetik kök hücrelerini (HSC'ler) izole etmek için ^{kurulmuştur1}. Kemik iliği SP hücreleri, CD117 ⁺ Sca-1 ^{+ Lin-Thy1 düşük} ekspresyonu ^3,4 ile karakterize edilen bir HSC popülasyo....

Protokol

Bu çalışmadaki deneylerde, yaşları 8 ila 12 hafta arasında değişen toplam 10 C57BL / 6 fare kullanılmıştır. Deneysel işlemler, Sichuan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (#201609309) tarafından onaylanan bir protokole uygun olarak gerçekleştirildi. Bu makalede kullanılan deneysel materyaller ve akış sitometrisi parametreleri Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Fare kemik iliği hücrelerinin izolasyonu ve toplanması

1. Fareleri kurumsal yönergelere sıkı sıkıya bağlı olarak ötenazi yapın. Farede bilinç kaybına neden olmak için,% 2 izofluran ile başlayan inhalasyon anesteziklerin....

Tartışmalar

Her biri 3-4 fare içeren ve toplam 10 fare ile sonuçlanan üç deney yapmak için açıklanan protokolü kullandık. SP hücrelerinin oranı %0.05 ile %0.76 arasında değişmektedir. Fareler arasında bireysel farklılıkların gözlendiğine dikkat etmek önemlidir. Hoechst örneklerini analiz etmek için dört akış sitometresi kullandık. Akış sitometrisinin yeni versiyonunda 20 mW 355 nm'lik bir lazerle Hoechst boyasının uyarılmasının, eski moda akış sitometrisindeki 100 mW 355 nm'lik bir lazere eşdeğe.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629