Détection efficace des cellules de la population du côté de Hoechst par cytométrie en flux

Résumé

Ici, nous montrons que les lasers haute puissance de 375 nm et 405 nm peuvent exciter efficacement Hoechst 33342 et servir d’alternative viable au laser 355 nm pour la détection de cellules de population latérale (SP), élargissant ainsi la gamme de lasers disponibles dans les applications de cytométrie en flux.

Résumé

Les cellules de la population latérale (SP) sont identifiées par coloration Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux (FCM). La méthode SP de Hoechst est utilisée pour l’isolement des cellules souches en fonction des propriétés d’efflux de colorant des transporteurs de cassette de liaison à l’ATP (ABC). La méthode a d’abord été utilisée pour l’identification et l’isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH), mais elle a maintenant évolué pour se concentrer principalement sur l’identification et l’isolement des cellules souches cancéreuses (CSC). La méthode de détection traditionnelle de la FCM utilise un laser de 355 nm pour exciter le colorant afin de détecter les cellules SP. Grâce à cette étude, nous avons réussi à identifier des approches alternatives pour l’excitation du colorant qui peuvent remplacer efficacement la détection des cellules SP à l’aide d’un laser de 355 nm. Ceci est réalisé grâce à l’utilisation de lasers haute puissance de 375 nm ou 405 nm. Cela nous permet d’exercer une sélectivité accrue dans la détection des cellules SP plutôt que de nous limiter uniquement à la cytométrie en flux laser de 355 nm.

Introduction

Les cellules de la population latérale (SP) sont identifiées par coloration Hoechst 33342 et analysées par cytométrie en flux (FCM). Les cellules SP sont caractérisées par le pompage du colorant d’ADN fluorescent hors des cellules par le biais de^{leur transporteur 1,2} de la cassette de liaison à l’ATP (ABC). La méthode a été établie à l’origine pour isoler les cellules souches hématopoïétiques (CSH) de la moelle osseuse ^murine1. Les cellules SP de la moelle osseuse ont été enrichies d’une population de CSH caractérisée par une^faible expression de CD117⁺Sca-1⁺

Protocole

Les expériences de cette étude ont utilisé un total de 10 souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines. Les opérations expérimentales ont été menées conformément à un protocole approuvé par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Sichuan (#201609309). Les matériaux expérimentaux et les paramètres de cytométrie en flux utilisés dans cet article sont répertoriés dans la Table des matériaux.

1. Isolement et prélèvement de cellules de moelle osseuse de souris

1. Euthanasier les souris en stricte conformité avec les directives de l’établissement. Pour induire une ....

Discussion

Nous avons utilisé le protocole décrit pour mener trois expériences, chaque essai impliquant 3 à 4 souris, ce qui a donné un total de 10 souris. La proportion de cellules SP variait de 0,05 % à 0,76 %. Il est important de noter que des variations individuelles ont été observées chez les souris. Nous avons utilisé quatre cytomètres en flux pour analyser les échantillons de Hoechst. On observe que l’excitation du colorant Hoechst par un laser de 20 mW 355 nm sur la nouvelle version de la cytométrie en flux e.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629