Detecção eficaz de células da população do lado de Hoechst por citometria de fluxo

Resumo

Aqui, mostramos que os lasers de alta potência de 375 nm e 405 nm podem efetivamente excitar o Hoechst 33342 e servir como uma alternativa viável ao laser de 355 nm para detecção de células da população lateral (SP), expandindo assim a gama de lasers disponíveis em aplicações de citometria de fluxo.

Resumo

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). O método Hoechst SP é utilizado para o isolamento de células-tronco com base nas propriedades de efluxo de corante de transportadores de de ligação de ATP (ABC). O método foi inicialmente empregado para a identificação e isolamento de células-tronco hematopoiéticas (HSCs), mas agora evoluiu para se concentrar principalmente na identificação e isolamento de células-tronco cancerígenas (CSCs). O método tradicional de detecção de FCM usa um laser de 355 nm para excitar o corante para detectar células SP. Por meio deste estudo, identificamos com sucesso abordagens alternativas para excitação de corante que podem efetivamente substituir a detecção de células SP usando um laser de 355 nm. Isso é conseguido através da utilização de lasers de alta potência de 375 nm ou 405 nm. Isso nos permite exercer seletividade aprimorada na detecção de células SP, em vez de nos limitarmos apenas à citometria de fluxo a laser de 355 nm.

Introdução

As células da população lateral (SP) são identificadas por meio da coloração Hoechst 33342 e analisadas por citometria de fluxo (FCM). As células SP são caracterizadas pelo bombeamento do corante de DNA fluorescente para fora das células através de seu transportador de de ligação a ATP (ABC) ^1,2. O método foi originalmente estabelecido para isolar células-tronco hematopoiéticas (HSCs^{) da} medula óssea murina1. As células SP da medula óssea foram enriquecidas com uma população de HSCs caracterizada por^baixa expressão de CD117⁺Sca-1^+Lin-Thy1

Protocolo

Os experimentos neste estudo utilizaram um total de 10 camundongos C57BL/6 com idades entre 8 e 12 semanas. As operações experimentais foram conduzidas de acordo com um protocolo aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Sichuan (#201609309). Os materiais experimentais e os parâmetros de citometria de fluxo usados neste artigo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Isolamento e coleta de células da medula óssea de camundongos

1. Eutanásia de camundongos em estrita conformidade com as diretrizes institucionais. Para induzir a inconsciência no camundongo, adm....

Discussão

Usamos o protocolo descrito para realizar três experimentos, com cada tentativa envolvendo 3-4 camundongos, resultando em um total de 10 camundongos. A proporção de células SP variou de 0,05% a 0,76%. É importante notar que variações individuais foram observadas entre os camundongos. Utilizamos quatro citômetros de fluxo para analisar as amostras de Hoechst. Observa-se que a excitação do corante Hoechst por um laser de 20 mW de 355 nm na nova versão da citometria de fluxo é equivalente à de um laser de 100 m.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629