フローサイトメトリーによるHoechst側集団細胞の効果的な検出

要約

ここでは、高出力の375 nmおよび405 nmレーザーがHoechst 33342を効果的に励起し、サイドポピュレーション(SP)細胞検出用の355 nmレーザーの実行可能な代替品として機能することを示し、それによりフローサイトメトリーアプリケーションで利用可能なレーザーの範囲が広がります。

要約

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。Hoechst SP法は、ATP結合カセット(ABC)トランスポーターの色素排出特性に基づく幹細胞の単離に利用されています。この方法は当初、造血幹細胞(HSC)の同定と単離に採用されましたが、現在では主にがん幹細胞(CSC)の同定と単離に焦点を当てるように進化しています。FCMの従来の検出法では、355 nmレーザーを使用して色素を励起し、SP細胞を検出します。この研究を通じて、355 nmレーザーを使用したSP細胞の検出を効果的に置き換えることができる色素励起の代替アプローチを特定することに成功しました。これは、高出力の375nmまたは405nmレーザーを利用することで実現されます。これにより、355 nmレーザーフローサイトメトリーのみに限定されるのではなく、SP細胞の検出において選択性を高めることができます。

概要

サイドポピュレーション(SP)細胞は、Hoechst 33342染色によって同定され、フローサイトメトリー(FCM)を使用して分析されます。SP細胞は、それらのATP結合カセット(ABC)トランス^{ポーター1,2}を介して、蛍光DNA色素を細胞からポンピングすることを特徴としている。この方法はもともと、マウスの骨髄造血幹細胞(HSC)を単離するために確立されました¹。骨髄SP細胞は、CD117⁺Sca-1^+Lin-Thy1低発現^3,4を特徴とするHSCの集団で濃縮されました。その後、この方法は、心筋⁵、肝臓⁶、肺⁷、腎臓⁸、および前脳⁹などの他の組織から幹細胞を単離し、濃縮するために広く使用されました。特に、この方法は過去10年間でがん幹細胞(CSC)の単離に適用されてきました。CSCは、腫瘍の開始、自己再生、化学療法に対する耐性、お....

プロトコル

この研究の実験では、8週齢から12週齢のC57BL/6マウスを合計10匹利用しました。実験的な操作は、四川大学の動物施設管理および使用委員会(#201609309)によって承認されたプロトコルに従って行われました。この記事で使用した実験材料とフローサイトメトリーのパラメータは、 材料の表に記載されています。

1. マウス骨髄細胞の単離と採取

1. 施設のガイドラインに厳密に従ってマウスを安楽死させます。マウスに意識喪失を誘発するには、2%イソフルランから吸入麻酔薬を投与し、続いて呼吸が止まるまで5%イソフルランへの投与量を徐々に増やします。.
2. 手術室またはヒューム食器棚でマウスを解剖します。マウスを70%エタノールで洗浄し、滅菌します。
3. 鋭利なハサミで脚の皮膚と筋肉を完全に切り、大腿骨を解剖します。
4. 乳鉢で大腿骨を砥石で優しく粉砕し、骨が白くなるまでDMEM培地で骨髄細胞を洗い流します。
5. 得られた骨髄細胞を100μmフィルターで15mLチューブにろ過します。800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
6. 上清を捨て、残存赤血球を1 mLの赤血球溶解バッファーで4°Cで1分間溶解します。 800 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 遠心分離後、再度DMEM....

ディスカッション

記載されているプロトコルを使用して3つの実験を行い、各試験には3〜4匹のマウスを使用し、合計10匹のマウスを作成しました。SP細胞の割合は0.05%から0.76%の範囲であった。マウス間で個々の変動が観察されたことに注意することが重要です。4つのフローサイトメーターを使用して、Hoechstサンプルを分析しました。新しいバージョンのフローサイトメトリーでの20 mW 355 nmレーザーによるHoechs.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629