通过流式细胞术有效检测 Hoechst 侧细胞群

摘要

在这里，我们展示了高功率 375 nm 和 405 nm 激光器可以有效地激发 Hoechst 33342，并作为 355 nm 激光器的可行替代方案进行侧群 （SP） 细胞检测，从而扩大了流式细胞术应用中可用激光器的范围。

摘要

通过 Hoechst 33342 染色鉴定侧群 （SP） 细胞，并使用流式细胞术 （FCM） 进行分析。Hoechst SP 方法用于基于 ATP 结合盒 （ABC） 转运蛋白的染料外排特性分离干细胞。该方法最初用于鉴定和分离造血干细胞 （HSC），但现在它已发展为主要侧重于癌症干细胞 （CSC） 的鉴定和分离。FCM 的传统检测方法是使用 355 nm 激光激发染料以检测 SP 细胞。通过这项研究，我们成功确定了染料激发的替代方法，可以有效替代使用 355 nm 激光检测 SP 细胞。这是通过使用高功率 375 nm 或 405 nm 激光器实现的。这使我们能够在检测 SP 细胞时发挥更高的选择性，而不仅仅是局限于 355 nm 激光流式细胞术。

引言

通过 Hoechst 33342 染色鉴定侧群 （SP） 细胞，并使用流式细胞术 （FCM） 进行分析。SP 细胞的特征是通过其 ATP 结合盒 （ABC） 转运蛋白将荧光 DNA 染料泵出细胞 ^1,2。该方法最初用于分离小鼠骨髓造血干细胞 （HSC）¹。骨髓 SP 细胞富含以 CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 低}表达 ^3,4 为特征的 HSC 群体。此后，该方法被广泛用于从其他组织中分离和富集干细胞，包括心肌⁵、肝脏⁶、肺⁷、肾脏⁸ 和前脑⁹。特别是，该方法在过去十年中已被应用于分离癌症干细胞 （CSC）。CSCs 代表一小群细胞，具有肿瘤发生、自我更新、化疗耐药和转移潜力¹⁰。CSCs 最初是在造血系统恶性肿瘤¹¹ 中发现的....

研究方案

本研究中的实验总共使用了 10 只年龄在 8 至 12 周之间的 C57BL/6 小鼠。实验操作是根据四川大学机构动物护理和使用委员会 （#201609309） 批准的方案进行的。本文中使用的实验材料和流式细胞术参数列在 材料表中。

1. 小鼠骨髓细胞的分离和收集

1. 严格按照机构指南对小鼠实施安乐死。为了诱导小鼠失去知觉，从 2% 异氟醚开始施用吸入麻醉剂，然后逐渐增加剂量至 5% 异氟醚，直到呼吸停止。
2. 解剖手术室或通风柜中的小鼠。用 70% 乙醇清洁和消毒小鼠。
3. 用锋利的剪刀完全剪断腿部的皮肤和肌肉，并解剖股骨。
4. 在研钵中用研磨棒轻轻压碎股骨，并用 DMEM 培养基冲洗骨髓细胞，直到骨头变白。
5. 用 100 μm 过滤器将获得的骨髓细胞过滤到 15 mL 试管中。在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。
6. 弃去上清液，用 1 mL 红细胞裂解缓冲液在 4 °C 下裂解残留的红细胞 1 分钟。 在 4 °C 下以 800 x g 离心 5 分钟。 离心后，再次用 DMEM 培养基洗涤。
7. 将细胞重悬于 2 mL 孵育溶液（DMEM 培养基 + 5% FBS）中，用自动细胞计数器计数细胞，并使用孵育溶液将细胞浓度调节至 1.0 x ....

讨论

我们使用所描述的方案进行了三个实验，每个试验涉及 3-4 只小鼠，总共产生 10 只小鼠。SP 细胞的比例范围为 0.05% 至 0.76%。值得注意的是，在小鼠中观察到个体差异。我们使用了四台流式细胞仪来分析 Hoechst 样品。据观察，在新型流式细胞术中，20 mW 355 nm 激光对 Hoechst 染料的激发与老式流式细胞术中 100 mW 355 nm 激光器的激发作用相当。这种现象可归因于两种系统中采用的激光器类型的差异。观?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629