Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной работе мы показываем, что мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм могут эффективно возбуждать Hoechst 33342 и служить жизнеспособной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм для обнаружения клеток боковой популяции (SP), тем самым расширяя диапазон доступных лазеров в приложениях проточной цитометрии.

Аннотация

Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). Метод Hoechst SP используется для выделения стволовых клеток на основе свойств оттока красителя транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC). Первоначально этот метод использовался для идентификации и выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но в настоящее время он эволюционировал и в первую очередь сосредоточился на идентификации и выделении раковых стволовых клеток (ОСК). Традиционный метод обнаружения FCM использует лазер с длиной волны 355 нм для возбуждения красителя для обнаружения SP-клеток. В ходе этого исследования мы успешно определили альтернативные подходы к возбуждению красителем, которые могут эффективно заменить обнаружение SP-клеток с помощью лазера с длиной волны 355 нм. Это достигается за счет использования мощных лазеров с длиной волны волны 375 нм или 405 нм. Это позволяет нам проявлять повышенную селективность при обнаружении SP-клеток, а не ограничиваться только лазерной проточной цитометрией с длиной волны 355 нм.

Введение

Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). SP-клетки характеризуются выкачиванием флуоресцентного красителя ДНК из клеток через их транспортер АТФ-связывающей кассеты (ABC) 1,2. Первоначально метод был разработан для выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга мышей1. SP-клетки костного мозга были обогащены популяцией ГСК, характеризующихся низкой экспрессией CD117+Sca-1+Lin-Thy1 3,4.

протокол

В экспериментах в этом исследовании приняли участие в общей сложности 10 мышей C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Экспериментальные операции проводились в соответствии с протоколом, который был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета (#201609309). Экспериментальные материалы и параметры проточной цитометрии, использованные в данной статье, приведены в Таблице материалов.

1. Выделение и забор клеток костного мозга мыши

  1. Усыпляйте мышей в строгом соответствии с рекомендациями учреждения. Чтобы вызвать потерю сознания у мышей, вводят и....

Результаты

На рисунке 2 контрольную группу лечили верапамилом, который блокирует транспортеры ABC в стволовых клетках для предотвращения элиминации Hoechst 33342. Таким образом, стволовые клетки в группе неверапамила вытесняют Hoechst 33342 и образуют отрицательную клеточную популяцию, извес.......

Обсуждение

Мы использовали описанный протокол для проведения трех экспериментов, в каждом из которых участвовало 3-4 мыши, в результате чего было получено в общей сложности 10 мышей. Доля SP-элементов колебалась от 0,05% до 0,76%. Важно отметить, что среди мышей наблюдались индивидуальные вариации. Мы исп?.......

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами J.H. от Национального фонда естественных наук Китая (No 81800207). Мы высоко ценим помощь компании Beckman Coulter, Inc. в обеспечении поддержки проточной цитометрии и калибровки параметров. Мы благодарим Цзяо Чэня из Государственной ключевой лаборатории болезней полости рта Западно-Китайской стоматологической больницы Сычуаньского университета и Юй Ци из Исследовательского центра регенеративной медицины Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета за их помощь в сборе данных проточной цитометрии.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Automatic cell counterCountstar1M1200
Cell Filter(100 µm)BIOFILCSS-013-100
Daily quality control fluorospheresBeckman CoulterB5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)CORNING10-013-CVRC
Fetal bovine serumCORNING35-081-CV
HBSSHycloneSH30030.02
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Propidium iodide (PI)Sigma-AldrichP4170
Red blood cell lysis bufferBeyotimeC3702
VerapamilSigma-AldrichV4629

Ссылки

  1. Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
  2. Zhou, S., et al.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE210

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены