זיהוי יעיל של תאי אוכלוסיית צד Hoechst על ידי ציטומטריית זרימה

Summary

כאן, אנו מראים כי לייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר יכולים לעורר ביעילות את Hoechst 33342 ולשמש חלופה בת קיימא ללייזר 355 ננומטר לזיהוי תאי אוכלוסיית צד (SP), ובכך להרחיב את טווח הלייזרים הזמינים ביישומי ציטומטריית זרימה.

Abstract

תאי אוכלוסיית הצד (SP) מזוהים באמצעות צביעת Hoechst 33342 ומנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה (FCM). שיטת Hoechst SP משמשת לבידוד תאי גזע בהתבסס על תכונות שטף הצבע של מובילי קלטות קושרות ATP (ABC). השיטה שימשה בתחילה לזיהוי ובידוד של תאי גזע המטופויטיים (HSCs), אך כעת היא התפתחה להתמקד בעיקר בזיהוי ובידוד של תאי גזע סרטניים (CSC). שיטת הזיהוי המסורתית של FCM משתמשת בלייזר 355 ננומטר כדי לעורר את הצבע כדי לזהות תאי SP. באמצעות מחקר זה, זיהינו בהצלחה גישות חלופיות לעירור צבע שיכולות להחליף ביעילות את הזיהוי של תאי SP באמצעות לייזר 355 ננומטר. זה מושג באמצעות שימוש בלייזרים בהספק גבוה של 375 ננומטר או 405 ננומטר. זה מאפשר לנו לתרגל סלקטיביות משופרת בזיהוי תאי SP במקום להיות מוגבלים אך ורק לציטומטריית זרימת לייזר של 355 ננומטר.

Introduction

תאי אוכלוסיית הצד (SP) מזוהים באמצעות צביעת Hoechst 33342 ומנותחים באמצעות ציטומטריית זרימה (FCM). תאי SP מאופיינים בשאיבת צבע הדנ"א הפלואורסצנטי מתוך התאים דרך טרנספורטר^קלטת קשירת ATP (ABC) ^1,2. השיטה הוקמה במקור לבידוד תאי גזע המטופויטיים של מח עצם מורין (HSCs)¹. תאי SP מח העצם הועשרו באוכלוסייה של HSCs המאופיינת בביטוי^נמוך CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 3,4}. לאחר מכן, נעשה שימוש נרחב בשיטה כדי לבודד ולהעשיר תאי גזע מרקמות אחרות, כולל שריר הלב⁵, כבד⁶, ריאות⁷, כליות⁸ ומוח קדמי⁹. בפרט, השיטה יושמה לבידוד תאי גזע סרטניים (CSC) בעשור האחרון. CSCs מייצגים אוכלוסייה קטנה של תאים בעלי תכונות של התחלת גידול, התחדשות עצמית, עמידות לכימותרפיה ופוטנציאל גרורתי¹⁰. CSCs זוהו בתחילה בממאירויות המטופויטיות¹¹ ולאחר מכן נצפו בגידולים מוצקים שונים כגון ערמונית¹², שחלות¹³, קיבה¹⁴, שד¹⁵ וקרצינומה ריאות¹⁶. למרות זמינותן של טכניקות שונות לזיהוי CSC, טכניקת SP נותרה בחירה מועדפת בשל תחולתה הרחבה על פני רקמות וקווי תאים מגוונים. יתר על כן, זוהי טכניקה רבת ערך המבודדת CSCs באמצעות מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS)16,17,18. ממצאי הניסוי מראים כי תאי SP מפגינים גידוליות בולטת ומציגים רמות ביטוי גבוהות של גנים הקשורים לתאי גזע^19,20. המחקר הקודם שלנו²¹ הראה גם כי ניתוח שעתוק של תאי SP מבודדים במיאלומה נפוצה מגלה העשרה של מסלולי איתות הקשורים לתאי גזע, כגון מסלול הקיפוד. בינתיים, ביצענו ניתוחי העשרת מסלולים על הגנים המתבטאים באופן דיפרנציאלי בתאי SP של לוקמיה מיאלוגנית חריפה²². הגנים שהשתנו הועשרו במסלולים הקשורים לתאי גזע (Wnt/β-catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch). מצאנו כי 1 x 10⁵ תאי SP יכולים ליצור גידולים בעכברי BALB/c null²², בעוד שתאים שאינם SP לא יכולים, מה שמצביע על כך שלתאי SP היו מאפיינים של תאי גזע לוקמיה. יעילותה של שיטת Hoechst SP בזיהוי CSCs ניכרת.

פרוטוקול Hoechst SP שוכלל ושופר באמצעות התקדמות המחקר. הפרוטוקול כולל בקרה קפדנית של ריכוז הצבע, צפיפות התא, טמפרטורת הדגירה ומשך, הרכב החיץ וערך ה- pH. דגימות התאים שהוכנו בהתאם לפרוטוקול זה עברו אנליזה ציטומטרית של זרימה. בשל העירור של צבע Hoechst עם לייזר UV ב 355 ננומטר וזיהוי הפליטה הפלואורסצנטית שלו באמצעות מסנן 690/50 ננומטר (Hoechst אדום) ומסנן 450/50 ננומטר (Hoechst Blue), לייזר 350 ננומטר נדרש עבור FCM. עם זאת, לייזרים של 350 ננומטר אינם מצוידים בדרך כלל ברוב מכשירי FCM בגלל עלותם הגבוהה. לפיכך, ניסינו למצוא גישה חלופית לעירור צבע לזיהוי יעיל של תאי SP על ידי ציטומטריית זרימה. במחקר זה, היכולת של לייזרים 375 ננומטר ו 405 ננומטר בגילוי תאי SP הושוותה לזו של לייזר 355 ננומטר. הממצאים שלנו מראים דמיון מדהים בין תאי SP שזוהו על ידי לייזרים של 355 ננומטר, 375 ננומטר ו-405 ננומטר. תוצאות אלה מצביעות על כך שהלייזרים בעוצמה גבוהה של 375 ננומטר ו- 405 ננומטר יכולים לשמש כחלופות אפשריות ללייזר 355 ננומטר לזיהוי תאי SP. הכללת מקורות אור עירור נוספים עבור Hoechst 33342 מקלה על השימוש במודלים נוספים של ציטומטריית זרימה.

Protocol

הניסויים במחקר זה השתמשו בסך הכל ב-10 עכברי C57BL/6 בגילאי 8 עד 12 שבועות. פעולות הניסוי נערכו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת סצ'ואן (#201609309). חומרים ניסיוניים והפרמטרים של ציטומטריית זרימה המשמשים במאמר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. בידוד ואיסוף של תאי מח עצם עכבר

1. יש להרדים עכברים בהתאם להנחיות המוסדיות. כדי לגרום לאובדן הכרה בעכבר, יש לתת חומרי הרדמה באינהלציה החל מ-2% איזופלורן, ולאחר מכן עלייה הדרגתית במינון ל-5% איזופלורן עד להפסקת הנשימה.
2. נתחו את העכברים בחדר הניתוח או בארון האדים. נקו ועיקרו את העכברים עם 70% אתנול.
3. חותכים את העור ואת שריר הרגל עם מספריים חדים לחלוטין לנתח את עצם הירך.
4. מרסקים את עצם הירך בעדינות עם מוט שחיקה במכתש ושוטפים את תאי מח העצם עם מדיום DMEM עד שהעצם הופכת לבנה.
5. סנן את תאי מח העצם המתקבלים עם מסנן 100 מיקרומטר לתוך צינורות 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C.
6. יש להשליך את שאריות תאי הדם האדומים של הסופרנאטנט והליז עם 1 מ"ל של חיץ ליזה של תאי דם אדומים למשך דקה אחת ב-4°C. צנטריפוגה ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, לשטוף שוב עם מדיום DMEM.
7. להשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של תמיסת הדגירה (DMEM בינוני + 5% FBS), לספור את התאים עם מונה תאים אוטומטי ולהתאים את ריכוז התא ל 1.0 x 10⁶ תאים / מ"ל עם תמיסת הדגירה.

2. צביעה סלולרית

1. תוספת 2 מ"ל של תרחיף תאי מח עצם מכל עכבר עם 5 מיקרוגרם / מ"ל Hoechst 33342. כדי עוד 1 מ"ל aliquot, להוסיף 100 μM verapamil כמו שליטה שלילית.
2. יש לדגור באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך 90 דקות עם תסיסה עדינה כל 30 דקות.
3. לאחר הדגירה, מקררים את התאים על קרח למשך 5 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב 250 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. השהה מחדש את התאים בתמיסת ריצה קרה (HBSS + 2% FBS). צנטריפוגה ב 4 ° C למשך 5 דקות ו להשליך את supernatant.
4. להשעות מחדש את גלולת התא המתקבלת ב 500 μL של פתרון פועל לכל דגימה. לפני ניתוח FCM, יש להשלים תאים עם 2 מיקרוגרם/מ"ל של פרופידיום יודיד (PI) ולהניח על קרח למשך כ-5 דקות.

3. ציטומטריית זרימה

הערה: לסיכום המערכות והתצורות השונות שבהן נעשה שימוש, ראה טבלה 1.

1. לכייל את ערכי מקדם השונות (CV) של התעלות הנדרשות באמצעות פלואורוספירות בקרת איכות יומית (QC) ב- FCM ולבצע בדיקות מדגמיות לאחר סיום מוצלח של בקרת איכות.
   1. בחר את קיצור הדרך לשולחן העבודה של התוכנה והפעל את התוכנה.
   2. בחר Start QC/Standardization בתפריט QC/Standardization כדי לגשת לניסוי QC.
   3. הכנס את צינור הדגימה של פלואורוספירות QC למחזיק הצינור.
   4. בחר התחל כדי לטעון את הדגימה ולהתחיל להפעיל את הליך QC. FCM מוכנים לשימוש לאחר מעבר QC.
2. עורר את צבע Hoechst 33342 של אותן דגימות עם לייזר 355 ננומטר, 375 ננומטר ו- 405 ננומטר, בהתאמה, לזיהוי אדום Hoechst בערוץ 690/50 ננומטר וכחול Hoechst בערוץ 450/50 ננומטר.
   1. צור ניסוי חדש באמצעות בחירה באפשרות 'ניסוי חדש ' בתפריט 'קובץ', ציין את נתיב הקובץ ושמור את הניסוי.
   2. בחרו 'הגדר ערוץ' בתפריט 'הגדרות'. בחר בתיבת הסימון אות ערוץ (Y585 , V450 , V660 , NUV450 , NUV660 , UV450 , UV660) ולאחר מכן הוסף את שם המגיב בעמודה תווית (585 יו': PI; V450: Hoechst Blue-405 ננומטר; V660: Hoechst אדום-405 ננומטר; NUV450: Hoechst Blue-375 ננומטר; NUV660: Hoechst Blue-375 ננומטר; UV450: Hoechst כחול-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 ננומטר).
   3. לחצו על סמלי 'התחלות צבע מדומה ' באזור ההתוויה ליצירת חלקות רחצה. בחר שם ציר כדי לשנות את הערוץ המוצג.
   4. לחץ על הוסף צינור במסך מבחנה כדי ליצור מבחנות מדגם חדשות ולשנות את שמותיהן.
   5. בחר הפעל כדי לטעון את הדגימה, להציג את החלקות וליצור את השערים. התאם את הגדרות הרווח והסף. בחר הקלט כדי לשמור את הנתונים.
3. עצב את לוגיקת הגדרת השער.
   1. עבור ההתוויה הראשונה, לחץ על ציר X כדי לבחור FSC-W ולחץ על ציר Y כדי לבחור FSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער A כדי להקיף את התא הבודד ולא לכלול תאים דבקים (איור 1A).
   2. עבור ההתוויה השניה, לחץ על ציר X כדי לבחור FSC-A ולחץ על ציר Y כדי לבחור SSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער B כדי להפריד תאים שאינם מקוטעים ולא לכלול פסולת תאית (איור 1B).
   3. עבור התרשים השלישי, לחץ על ציר X כדי לבחור PI-A ולחץ על ציר Y כדי לבחור SSC-A. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער D. בחר תאים חיים המציגים PI שלילי (איור 1C) וצייר את שער C כדי לקבל תאים חיים.
   4. עבור ההתוויה הדו-ממדית הרביעית, לחץ על ציר X כדי לבחור Hoechst Red ולחץ על ציר Y כדי לבחור Hoechst Blue. לחץ לחיצה ימנית על התוויית ובחר מאפיין מהתפריט הנפתח. בחר 'עיצוב ליניארי' fאו גם ציר X וגם ציר Y. בחר שער מצולע כדי לצייר את שער SP כדי לקבל תאי SP (איור 1D).
4. כדי להעריך את זכאות הדגימה, השתמש ב- 355 ננומטר של ציטומטר זרימה ספציפי²³ לזיהוי תאי SP.
5. השתמש בלייזרים 355 ננומטר (עוצמת לייזר: 20 mW) ו- 405 ננומטר (עוצמת לייזר: 80 mW) בו זמנית כדי לזהות הן את תאי הבקרה (עם תוספת verapamil) והן את תאי הניסוי.
6. קבל אותות פלואורסצנטיים בתעלות 690/50 ננומטר ו- 450/50 ננומטר המתאימות לשני הלייזרים. שימו לב לגירוי היעיל של צבע Hoechst 33342 באמצעות לייזרים של 355 ננומטר ו-405 ננומטר עם תאי SP שקופים (איור 2B-C).
7. עבור אותן דגימות, השתמש בלייזרים 375 ננומטר (עוצמת לייזר: 60 mW) ו- 405 ננומטר (עוצמת לייזר: 80 mW) לזיהוי תאים.

תוצאות

באיור 2, קבוצת הביקורת טופלה באמצעות verapamil, אשר חוסם טרנספורטרים ABC בתאי גזע כדי למנוע את חיסול Hoechst 33342. בכך, תאי הגזע בקבוצה הלא-וראפמילית מגרשים את Hoechst 33342 ויוצרים אוכלוסיית תאים שלילית הידועה בשם תאי SP. לייזר 355 ננומטר עורר ביעילות את הצבע Hoechst 33342, וכתוצאה מכך תצפית ברורה על...

Discussion

השתמשנו בפרוטוקול המתואר כדי לערוך שלושה ניסויים, כאשר כל ניסוי כלל 3-4 עכברים, והתוצאה הייתה בסך הכל 10 עכברים. חלקם של תאי SP נע בין 0.05% ל -0.76%. חשוב לציין כי נצפו וריאציות אינדיבידואליות בקרב העכברים. השתמשנו בארבעה ציטומטרים של זרימה כדי לנתח את דגימות Hoechst. נצפה כי עירור של צבע Hoechst על ידי ליי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629