Effektiver Nachweis von Zellen der Hoechst-Seitenpopulation mittels Durchflusszytometrie

Zusammenfassung

Hier zeigen wir, dass Hochleistungslaser 375 nm und 405 nm Laser Hoechst 33342 effektiv anregen und als praktikable Alternative zum 355 nm Laser für die Detektion von Seitenpopulationszellen (SP) dienen können, wodurch das Spektrum der verfügbaren Laser in der Durchflusszytometrie erweitert wird.

Zusammenfassung

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Das Hoechst SP-Verfahren wird für die Isolierung von Stammzellen auf der Grundlage der Farbstoffausflusseigenschaften von ATP-bindenden Kassette (ABC)-Transportern eingesetzt. Die Methode wurde ursprünglich für die Identifizierung und Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) eingesetzt, hat sich aber weiterentwickelt und konzentriert sich nun hauptsächlich auf die Identifizierung und Isolierung von Krebsstammzellen (CSCs). Bei der traditionellen Detektionsmethode von FCM wird ein 355-nm-Laser verwendet, um den Farbstoff zum Nachweis von SP-Zellen anzuregen. Durch diese Studie ist es uns gelungen, alternative Ansätze zur Farbstoffanregung zu identifizieren, die die Detektion von SP-Zellen mit einem 355-nm-Laser effektiv ersetzen können. Dies wird durch den Einsatz von Hochleistungslasern mit 375 nm oder 405 nm erreicht. Dies ermöglicht es uns, eine verbesserte Selektivität bei der Detektion von SP-Zellen auszuüben, anstatt nur auf die 355-nm-Laser-Durchflusszytometrie beschränkt zu sein.

Einleitung

Die Zellen der Seitenpopulation (SP) werden durch Hoechst 33342-Färbung identifiziert und mittels Durchflusszytometrie (FCM) analysiert. Die SP-Zellen zeichnen sich dadurch aus, dass der fluoreszierende DNA-Farbstoff durch ihren ATP-bindenden Kassettentransporter⁽ABC) ^1,2 aus den Zellen gepumpt wird. Die Methode wurde ursprünglich für die Isolierung von hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) des murinen Knochenmarks ^etabliert1. Die Knochenmark-SP-Zellen wurden mit einer Population von HSCs angereichert, die durch eine^niedrige CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1-Expre....}

Protokoll

Die Experimente in dieser Studie verwendeten insgesamt 10 C57BL/6-Mäuse im Alter zwischen 8 und 12 Wochen. Die Versuche wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Sichuan University (#201609309) genehmigt wurde. Die experimentellen Materialien und die Parameter der Durchflusszytometrie, die in diesem Artikel verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Isolierung und Entnahme von Knochenmarkzellen der Maus

1. Euthanasieren Sie Mäuse in strikter Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien. Um bei der Maus....

Diskussion

Wir verwendeten das beschriebene Protokoll, um drei Experimente durchzuführen, wobei jeder Versuch 3-4 Mäuse umfasste, was zu insgesamt 10 Mäusen führte. Der Anteil der SP-Zellen lag zwischen 0,05 % und 0,76 %. Es ist wichtig zu beachten, dass bei den Mäusen individuelle Unterschiede beobachtet wurden. Wir setzten vier Durchflusszytometer ein, um die Hoechst-Proben zu analysieren. Es wird beobachtet, dass die Anregung des Hoechst-Farbstoffs durch einen 20 mW 355 nm Laser auf der neuen Version der Durchflusszytometri.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629