Detección eficaz de células poblacionales del lado de Hoechst mediante citometría de flujo

Resumen

Aquí, demostramos que los láseres de alta potencia de 375 nm y 405 nm pueden excitar eficazmente Hoechst 33342 y servir como una alternativa viable al láser de 355 nm para la detección de células de población lateral (SP), ampliando así la gama de láseres disponibles en aplicaciones de citometría de flujo.

Resumen

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). El método SP de Hoechst se utiliza para el aislamiento de células madre en función de las propiedades de eflujo de colorante de los transportadores de casetes de unión a ATP (ABC). El método se empleó inicialmente para la identificación y el aislamiento de células madre hematopoyéticas (HSC), pero ahora ha evolucionado para centrarse principalmente en la identificación y el aislamiento de células madre cancerosas (CSC). El método de detección tradicional de FCM utiliza un láser de 355 nm para excitar el tinte y detectar células SP. A través de este estudio, hemos identificado con éxito enfoques alternativos para la excitación del colorante que pueden reemplazar eficazmente la detección de células SP utilizando un láser de 355 nm. Esto se logra mediante la utilización de láseres de alta potencia de 375 nm o 405 nm. Esto nos permite ejercer una selectividad mejorada en la detección de células SP en lugar de limitarnos únicamente a la citometría de flujo láser de 355 nm.

Introducción

Las células de la población lateral (SP) se identifican mediante tinción de Hoechst 33342 y se analizan mediante citometría de flujo (FCM). Las células SP se caracterizan por el bombeo del tinte de ADN fluorescente fuera de las células a través de su transportador de casete de unión a ATP (ABC) ^1,2. El método se estableció originalmente para aislar células madre hematopoyéticas (HSC) de médula ósea murina1^. Las células SP de médula ósea se enriquecieron con una población de HSCs caracterizadas por CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 de baja} expresión

Protocolo

Los experimentos de este estudio utilizaron un total de 10 ratones C57BL/6 de entre 8 y 12 semanas de edad. Las operaciones experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con un protocolo que fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Sichuan (#201609309). Los materiales experimentales y los parámetros de citometría de flujo utilizados en este artículo se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Aislamiento y recolección de células de médula ósea de ratón

1. Eutanasia de ratones en estricta conformidad con las directrices institucionales. Para inducir la in....

Discusión

Utilizamos el protocolo descrito para llevar a cabo tres experimentos, con cada ensayo con 3-4 ratones, lo que resultó en un total de 10 ratones. La proporción de células SP osciló entre el 0,05% y el 0,76%. Es importante tener en cuenta que se observaron variaciones individuales entre los ratones. Utilizamos cuatro citómetros de flujo para analizar las muestras de Hoechst. Se observa que la excitación del colorante de Hoechst por un láser de 20 mW a 355 nm en la nueva versión de la citometría de flujo es equiva.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629