Rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di Hoechst mediante citometria a flusso

Riepilogo

Qui, dimostriamo che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono eccitare efficacemente Hoechst 33342 e fungere da valida alternativa al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule di popolazione laterale (SP), ampliando così la gamma di laser disponibili nelle applicazioni di citometria a flusso.

Abstract

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Il metodo Hoechst SP viene utilizzato per l'isolamento di cellule staminali in base alle proprietà di efflusso del colorante dei trasportatori a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato inizialmente impiegato per l'identificazione e l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche (HSC), ma ora si è evoluto per concentrarsi principalmente sull'identificazione e l'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC). Il metodo di rilevamento tradizionale della FCM utilizza un laser a 355 nm per eccitare il colorante per rilevare le cellule SP. Attraverso questo studio, abbiamo identificato con successo approcci alternativi per l'eccitazione del colorante che possono sostituire efficacemente la rilevazione di cellule SP utilizzando un laser a 355 nm. Ciò si ottiene attraverso l'utilizzo di laser ad alta potenza da 375 nm o 405 nm. Ciò ci consente di esercitare una maggiore selettività nel rilevamento delle cellule SP piuttosto che limitarci esclusivamente alla citometria a flusso laser a 355 nm.

Introduzione

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Le cellule SP sono caratterizzate dal pompaggio del colorante fluorescente di DNA fuori dalle cellule attraverso il loro trasportatore ^1,2 a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato originariamente stabilito per isolare le cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo ^murino1. Le cellule SP del midollo osseo sono state arricchite con una popolazione di HSCs caratterizzate da CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 a bassa} espressione ^3,4. Successivamente, il metodo è stato ampiamente utilizzato per isolare e arricchire le cellule staminali da altri tessuti, tra cui il muscolo cardiaco⁵, il fegato⁶, il polmone⁷, il rene⁸ e il proencefalo⁹. In particolare, il metodo è stato applicato per isolare le cellule staminali tumorali (CSC) nell'ultimo decennio. Le CSCs rappresentano una piccola popolazione di cellule che possiedono le proprietà di inizio del tumore, autorinnovamento, resistenza alla chemioterapia e potenziale metastatico¹⁰. Le CSC sono state inizialmente identificate nelle neoplasie ematopoietiche¹¹ e successivamente osservate in vari tumori solidi come i carcinomi della prostata¹², dell'ovaio¹³, dello stomaco¹⁴, della mammella¹⁵ e del polmone¹⁶. Nonostante la disponibilità di varie tecniche per l'identificazione delle CSC, la tecnica SP rimane una scelta privilegiata grazie alla sua ampia applicabilità su diversi tessuti e linee cellulari. Inoltre, è una tecnica preziosa che isola le CSC utilizzando la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)16,17,18. I risultati sperimentali dimostrano che le cellule SP mostrano una pronunciata tumorigenicità e mostrano elevati livelli di espressione dei geni associati alle cellule staminali^19,20. Il nostro precedente studio²¹ ha anche dimostrato che l'analisi trascrittomica di cellule SP isolate nel mieloma multiplo rivela un arricchimento delle vie di segnalazione associate alle cellule staminali, come la via del riccio. Nel frattempo, abbiamo eseguito analisi di arricchimento del pathway sui geni differenzialmente espressi nelle cellule SP della leucemia mieloide acuta²². I geni alterati sono stati arricchiti in percorsi correlati alle cellule staminali (Wnt/β-catenina, TGF-β, Hedgehog, Notch). Abbiamo scoperto che 1 x 10⁵ cellule SP potevano formare tumori nei topi BALB/c null²², mentre le cellule non-SP non potevano, indicando che le cellule SP avevano caratteristiche delle cellule staminali della leucemia. L'efficacia del metodo Hoechst SP nell'identificazione delle CSC è evidente.

Il protocollo Hoechst SP è stato perfezionato e migliorato attraverso il progresso della ricerca. Il protocollo prevede un controllo rigoroso della concentrazione del colorante, della densità cellulare, della temperatura e della durata di incubazione, della composizione del tampone e del valore del pH. I campioni cellulari preparati in conformità a questo protocollo sono stati sottoposti ad analisi citofluorimetrica. A causa dell'eccitazione del colorante Hoechst con un laser UV a 355 nm e del rilevamento della sua emissione di fluorescenza utilizzando sia un filtro da 690/50 nm (Hoechst Red) che un filtro da 450/50 nm (Hoechst Blue), per la FCM è necessario un laser a 350 nm. Tuttavia, i laser a 350 nm non sono comunemente equipaggiati nella maggior parte degli FCM a causa del loro costo elevato. Quindi, abbiamo cercato di trovare un approccio alternativo per l'eccitazione del colorante per la rilevazione efficace delle cellule SP mediante citometria a flusso. In questo studio, è stata valutata la capacità dei laser a 375 nm e 405 nm di rilevare le cellule SP e confrontata con quella del laser a 355 nm. I nostri risultati dimostrano una notevole somiglianza tra le celle SP rilevate dai laser a 355 nm, 375 nm e 405 nm. Questi risultati suggeriscono che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono fungere da alternative fattibili al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule SP. L'inclusione di ulteriori sorgenti luminose di eccitazione per Hoechst 33342 facilita l'uso di più modelli di citometria a flusso.

Protocollo

Gli esperimenti di questo studio hanno utilizzato un totale di 10 topi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane. Le operazioni sperimentali sono state condotte in conformità con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan (#201609309). I materiali sperimentali e i parametri della citometria a flusso utilizzati in questo articolo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento e raccolta di cellule di midollo osseo di topo

1. Eutanasia dei topi in stretta conformità con le linee guida istituzionali. Per indurre l'incoscienza nel topo, somministrare anestetici per inalazione iniziando con isoflurano al 2%, seguito da un aumento graduale del dosaggio fino al 5% di isoflurano fino alla cessazione della respirazione.
2. Sezionare i topi nella sala chirurgica o nella cappa aspirante. Pulisci e sterilizza i topi con etanolo al 70%.
3. Tagliare completamente la pelle e il muscolo della gamba con forbici affilate e sezionare i femori.
4. Schiacciare delicatamente il femore con una bacchetta di macinazione in un mortaio e sciacquare le cellule del midollo osseo con DMEM fino a quando l'osso diventa bianco.
5. Filtrare le cellule del midollo osseo ottenute con un filtro da 100 μm in provette da 15 mL. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C.
6. Eliminare il surnatante e lisare i globuli rossi residui con 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi per 1 minuto a 4 °C. Centrifugare a 800 x g per 5 min a 4 °C. Dopo la centrifugazione, lavare nuovamente con mezzo DMEM.
7. Risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di incubazione (terreno DMEM + 5% FBS), contare le cellule con un contatore automatico di cellule e regolare la concentrazione delle cellule a 1,0 x 10⁶ cellule/mL con soluzione di incubazione.

2. Colorazione cellulare

1. Integrare 2 mL di sospensione di cellule del midollo osseo da ciascun topo con 5 μg/mL di Hoechst 33342. Ad un'altra aliquota da 1 mL, aggiungere 100 μM di verapamil come controllo negativo.
2. Incubare a bagnomaria a 37 °C per 90 min agitando delicatamente ogni 30 min.
3. Dopo l'incubazione, raffreddare le cellule con ghiaccio per 5 minuti e poi centrifugare a 250 x g per 5 minuti a 4 °C. Risospendere le cellule in una soluzione di funzionamento a freddo (HBSS + 2% FBS). Centrifugare a 4 °C per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
4. Risospendere il pellet di cella risultante in 500 μl di soluzione di corsa per campione. Prima dell'analisi FCM, integrare le cellule con 2 μg/mL di ioduro di propidio (PI) e metterle su ghiaccio per circa 5 minuti.

3. Citometria a flusso

NOTA: Per un riepilogo dei vari sistemi e configurazioni utilizzati, vedere la Tabella 1.

1. Calibrare i valori del coefficiente di variazione (CV) dei canali richiesti utilizzando le fluorosfere di controllo qualità giornaliero (QC) negli FCM ed eseguire test a campione dopo aver completato con successo il controllo di qualità.
   1. Seleziona il collegamento sul desktop del software e avvia il software.
   2. Selezionare Avvia controllo qualità/standardizzazione nel menu Controllo qualità/Standardizzazione per accedere all'esperimento Controllo qualità.
   3. Inserire la provetta del campione QC fluorospheres nel supporto della provetta.
   4. Selezionare Avvia per caricare il campione e iniziare a eseguire la procedura QC. Gli FCM sono pronti per l'uso dopo il superamento del controllo qualità.
2. Eccita il colorante Hoechst 33342 degli stessi campioni con un laser a 355 nm, 375 nm e 405 nm, rispettivamente, per il rilevamento del rosso Hoechst nel canale 690/50 nm e del blu Hoechst nel canale 450/50 nm.
   1. Per creare un nuovo esperimento, scegliere Nuovo esperimento dal menu File, specificare il percorso del file e salvare l'esperimento.
   2. Seleziona Imposta canale nel menu Impostazioni. Selezionare la casella di controllo del segnale del canale (Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660), quindi aggiungere il nome del reagente nella colonna Etichetta (Y585: PI; V450: Blu Hoechst-405 nm; V660: rosso Hoechst-405 nm; NUV450: Blu Hoechst-375 nm; NUV660: blu Hoechst-375 nm; UV450: Blu Hoechst-355nm; UV660: Blu Hoechst-355 nm).
   3. Fare clic sulle icone Pseudo grafici a colori nell'area del tracciato per creare i grafici. Selezionare il nome di un asse per modificare il canale visualizzato.
   4. Fare clic su Aggiungi provetta nella schermata Provetta per creare nuove provette e modificarne i nomi.
   5. Selezionare Esegui per caricare il campione, visualizzare i grafici e stabilire i gate. Regolare le impostazioni di guadagno e soglia. Seleziona Registra per salvare i dati.
3. Progettare la logica di impostazione del gate.
   1. Per il primo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare FSC-W e fare clic sull'asse Y per selezionare FSC-A. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate A per cerchiare la singola cella ed escludere le celle aderenti (Figura 1A).
   2. Per il secondo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare FSC-A e fare clic sull'asse Y per selezionare SSC-A. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate B per separare le celle non frammentarie ed escludere i detriti cellulari (Figura 1B).
   3. Per il terzo grafico, fare clic sull'asse X per selezionare PI-A e fare clic sull'asse Y per selezionare SSC-A. Selezionare il Polygon Gate per disegnare il gate D. Selezionare le celle vive che mostrano PI negativo (Figura 1C) e disegnare il gate C per ottenere le celle live.
   4. Per il quarto grafico bidimensionale, fare clic sull'asse X per selezionare Hoechst Red e fare clic sull'asse Y per selezionare Hoechst Blue. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul grafico e selezionare Proprietà dal menu a discesa. Selezionare Formato lineare fo sia l'asse X che l'asse Y. Selezionare Polygon Gate per disegnare il gate SP per ottenere le celle SP (Figura 1D).
4. Per valutare l'idoneità del campione, utilizzare 355 nm di un citometro a flusso specifico²³ per il rilevamento delle cellule SP.
5. Utilizzare contemporaneamente i laser da 355 nm (potenza laser: 20 mW) e 405 nm (potenza laser: 80 mW) per rilevare sia le celle di controllo (con aggiunta di verapamil) che le celle sperimentali.
6. Acquisire segnali di fluorescenza ai canali 690/50 nm e 450/50 nm corrispondenti ai due laser. Osservare l'efficace stimolazione del colorante Hoechst 33342 con laser a 355 nm e 405 nm con cellule SP trasparenti (Figura 2B-C).
7. Per gli stessi campioni, utilizzare i laser da 375 nm (potenza laser: 60 mW) e 405 nm (potenza laser: 80 mW) per il rilevamento cellulare.

Risultati

Nella Figura 2, il gruppo di controllo è stato trattato con verapamil, che blocca i trasportatori ABC nelle cellule staminali per prevenire l'eliminazione di Hoechst 33342. In tal modo, le cellule staminali del gruppo non-verapamil espellono Hoechst 33342 e formano una popolazione cellulare negativa nota come cellule SP. Il laser a 355 nm ha eccitato efficacemente il colorante Hoechst 33342, ottenendo una chiara osservazione delle cellule SP del midollo osseo (Figura 2A...

Discussione

Abbiamo utilizzato il protocollo descritto per condurre tre esperimenti, con ogni prova che ha coinvolto 3-4 topi, per un totale di 10 topi. La percentuale di cellule SP variava dallo 0,05% allo 0,76%. È importante notare che sono state osservate variazioni individuali tra i topi. Abbiamo utilizzato quattro citometri a flusso per analizzare i campioni di Hoechst. Si è osservato che l'eccitazione del colorante Hoechst da parte di un laser da 20 mW 355 nm sulla nuova versione della citometria a flusso è equivalente a qu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629