Rilevamento efficace delle cellule della popolazione laterale di Hoechst mediante citometria a flusso

Riepilogo

Qui, dimostriamo che i laser ad alta potenza da 375 nm e 405 nm possono eccitare efficacemente Hoechst 33342 e fungere da valida alternativa al laser a 355 nm per il rilevamento di cellule di popolazione laterale (SP), ampliando così la gamma di laser disponibili nelle applicazioni di citometria a flusso.

Abstract

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Il metodo Hoechst SP viene utilizzato per l'isolamento di cellule staminali in base alle proprietà di efflusso del colorante dei trasportatori a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato inizialmente impiegato per l'identificazione e l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche (HSC), ma ora si è evoluto per concentrarsi principalmente sull'identificazione e l'isolamento di cellule staminali tumorali (CSC). Il metodo di rilevamento tradizionale della FCM utilizza un laser a 355 nm per eccitare il colorante per rilevare le cellule SP. Attraverso questo studio, abbiamo identificato con successo approcci alternativi per l'eccitazione del colorante che possono sostituire efficacemente la rilevazione di cellule SP utilizzando un laser a 355 nm. Ciò si ottiene attraverso l'utilizzo di laser ad alta potenza da 375 nm o 405 nm. Ciò ci consente di esercitare una maggiore selettività nel rilevamento delle cellule SP piuttosto che limitarci esclusivamente alla citometria a flusso laser a 355 nm.

Introduzione

Le cellule della popolazione laterale (SP) vengono identificate mediante colorazione Hoechst 33342 e analizzate mediante citometria a flusso (FCM). Le cellule SP sono caratterizzate dal pompaggio del colorante fluorescente di DNA fuori dalle cellule attraverso il loro trasportatore ^1,2 a cassetta legante l'ATP (ABC). Il metodo è stato originariamente stabilito per isolare le cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo ^murino1. Le cellule SP del midollo osseo sono state arricchite con una popolazione di HSCs caratterizzate da CD117⁺Sca-1^+Lin-Thy1

Protocollo

Gli esperimenti di questo studio hanno utilizzato un totale di 10 topi C57BL/6 di età compresa tra 8 e 12 settimane. Le operazioni sperimentali sono state condotte in conformità con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Sichuan (#201609309). I materiali sperimentali e i parametri della citometria a flusso utilizzati in questo articolo sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Isolamento e raccolta di cellule di midollo osseo di topo

1. Eutanasia dei topi in stretta conformità con le linee guida istituzionali. Per indurre l'incosci....

Discussione

Abbiamo utilizzato il protocollo descritto per condurre tre esperimenti, con ogni prova che ha coinvolto 3-4 topi, per un totale di 10 topi. La percentuale di cellule SP variava dallo 0,05% allo 0,76%. È importante notare che sono state osservate variazioni individuali tra i topi. Abbiamo utilizzato quattro citometri a flusso per analizzare i campioni di Hoechst. Si è osservato che l'eccitazione del colorante Hoechst da parte di un laser da 20 mW 355 nm sulla nuova versione della citometria a flusso è equivalente a qu.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629