Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية مقيمة فريدة في شبكية العين ، وتلعب أدوارا حاسمة في العديد من الأمراض التنكسية في شبكية العين. يمكن أن يؤدي إنشاء نموذج زراعة مشتركة لعضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة إلى تسهيل فهم أفضل للتسبب في أمراض الشبكية والتقدم التنموي.

Abstract

نظرا لمحدودية الوصول إلى شبكية العين البشرية ، فإن عضويات الشبكية (ROs) هي أفضل نموذج لدراسة أمراض الشبكية البشرية ، والتي يمكن أن تكشف عن آلية تطور الشبكية وحدوث أمراض الشبكية. الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) هي بلاعم مقيمة فريدة من نوعها في شبكية العين والجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتخدم وظائف المناعة الحاسمة. ومع ذلك ، تفتقر الكائنات العضوية في شبكية العين إلى الخلايا الدبقية الصغيرة لأن أصل تمايزها هو كيس الصفار. لا يزال التسبب المحدد للخلايا الدبقية الصغيرة في أمراض الشبكية هذه غير واضح. لذلك ، تبين أن إنشاء نموذج عضوي شبكي مدمج في الخلايا الدبقية الصغيرة أمر ضروري. هنا ، نجحنا في بناء نموذج مشترك من عضويات الشبكية مع الخلايا الدبقية الصغيرة المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية. في هذه المقالة ، قمنا بتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة ثم شاركنا في الاستزراع إلى عضويات الشبكية في المرحلة المبكرة. كدمج للخلايا المناعية ، يوفر هذا النموذج منصة محسنة لنمذجة أمراض الشبكية وفحص الأدوية لتسهيل البحث المتعمق حول التسبب في أمراض الشبكية والجهاز العصبي المركزي وعلاجها.

Introduction

كمصدر محدود لشبكية العين البشرية ، يمثل تمايز الخلايا الجذعية البشرية إلى عضويات شبكية ثلاثية الأبعاد (3D) نموذجا واعدا في المختبر لمحاكاة شبكية العين1. يحتوي على أنواع مختلفة من الخلايا في شبكية العين ، بما في ذلك المستقبلات الضوئية وخلايا العقدة الشبكية والخلايا ثنائية القطب وخلايا مولر والخلايا الأفقية والخلايا النجمية2. يتيح هذا النموذج محاكاة ودراسة كل من آليات نمو الشبكية والتسبب في أمراض الشبكية. ومع ذلك ، بسبب طريقة التمايز الاتجاهي ، تم اشتقاق عضويات الشبكية من الأديم الظاهر العصبي3 ، والتي تفتقر إلى العديد من أنواع الخلايا الأخرى التي تنشأ من طبقات جرثومية مختلفة ، مثل الخلايا الدبقية الصغيرة من كيس الصفار والخلايا المحيطة بالأوعية الدموية من الأديم المتوسط4،5،6.

في الوقت الحاضر ، ثبت أن العديد من أمراض الشبكية ، مثل التهاب الشبكية الصباغي7 ، والزرق8 ، والورم الأرومي الشبكي9 ، ترتبط ارتباطا وثيقا بالخلايا الدبقية الصغيرة داخل شبكية العين. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود نماذج بحثية مناسبة ، لا تزال الآليات المحددة التي توضح العلاقة بين الخلايا الدبقية الصغيرة وهذه الأمراض غير واضحة. في حين أن الفئران كانت بمثابة نموذج مناسب لدراسة أمراض الشبكية ، فقد أبرزت الدراسات الحديثة اختلافات كبيرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة للفأر والإنسان من حيث العمر ومعدل الانتشار وغياب الجينات البشريةالمتماثلة 10,11. أشارت هذه النتائج إلى أن الاستنتاجات المستخلصة من نماذج الفئران قد لا تكون موثوقة تماما ، مما يؤكد أهمية بناء عضويات شبكية العين البشرية التي تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة.

على مدى العقود القليلة الماضية ، تم تطوير طرق مختلفة للتمايز ثلاثي الأبعاد لعضويات الشبكية12,13. لتسهيل عملية الاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة داخل عضويات الشبكية ، اخترنا طريقة تمايز تتضمن الانتقال من ثقافة الالتصاق إلى ثقافة التعليق. يتيح هذا النهج بنجاح دمج الخلايا الدبقية الصغيرة في عضويات الشبكية ، والحفاظ عليها لمدة 60 يوما على الأقل14.

Protocol

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات المؤسسية لمستشفى بكين تونغرن ، جامعة العاصمة الطبية. كان خط خلية HESCs H9 من معهد أبحاث WiCell. قم بتسخين وسط زراعة الخلايا مسبقا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة قبل التجربة.

1. توليد الخلايا الدبقية الصغيرة البشرية

  1. استزرع hESCs في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل كثافة الخلية إلى 80٪ -90٪. بذر ما لا يقل عن 1 × 106 خلايا في كل بئر.
  2. نضح وسط الخلايا الجذعية وشطف الخلايا باستخدام 1x DPBS (1 مل / بئر من 6 صفيحة بئر). تتطلب الخطوة التالية 2 × 107-1 × 108 خلايا. إذا لم يكن ذلك كافيا ، فقم بدمج خلايا 2-5 آبار للقيام بالخطوات التالية.
  3. فصل مستعمرات الخلايا الجذعية باستخدام محلول EDTA 0.5 mM لمدة 5 دقائق تقريبا في حاضنة 37 درجة مئوية (1 مل / بئر من 6 صفيحة بئر).
  4. تحقق من مورفولوجيا المستعمرة بعد 5 دقائق. عندما تكون حواف المستعمرة ملتفة قليلا مع وجود فجوات فضفاضة ، تكون الخلايا جاهزة للتمايز واستنشاق EDTA. إذا لم يكن كذلك ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة أخرى. لا تحتضن لمدة تزيد عن 8 دقائق.
  5. اشطف الخلايا برفق في كل بئر باستخدام 6 مل من Medium A (الجدول 1) مع 6 ميكرولتر من محلول مثبط 10 mM ROCK Y-27632. اضغط برفق على الجزء السفلي من الطبق للمساعدة في شطف الخلايا. اضبط اليوم على أنه اليوم 0.
    ملاحظة: لا ماصة الخلايا. ستشكل الخلايا أجساما جنينية (EBs) في اليوم التالي.
  6. بعد 24 ساعة ، راقب الخلايا الموجودة تحت المجهر لتأكيد تكوين EB. اجمع EBs في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع ماصة سعة 10 مل وانتظر حتى تستقر EBs في القاع في غضون 5 دقائق.
  7. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق EBs ب 6 مل من Medium A الطازج وانقلها إلى بئر جديد منخفض الالتصاق من 6 آبار. الثقافة في حاضنة 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: الغرض من نقل البئر في اليوم 1 هو تقليل تأثير عدد كبير من الخلايا الميتة أثناء عملية تكوين EB ، مما قد يؤثر على حالة نمو الخلايا.
  8. قم بتحديث Medium A الطازج يوميا حتى اليوم الرابع (6 مل / بئر من 6 آبار).
  9. في اليوم الرابع ، قم بتغطية طبق 10 سم ب 3 مل من محلول جيلاتين السمك 0.1٪ لمدة ساعة على الأقل في حاضنة 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: إذا كان وقت الطلاء أقل من 1 ساعة ، فمن الصعب تنفيذ الخطوات التالية.
  10. اجمع EBs بعناية في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل مع ماصة سعة 10 مل وانتظر حتى تستقر EBs في القاع في غضون 5 دقائق.
  11. قم بإزالة محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ وشطف الطبق 10 سم مرة واحدة باستخدام 5-6 مل من 1x DPBS. إزالة DPBS.
  12. أعد تعليق EBs برفق مع 15 مل من Medium B (الجدول 1) في أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل وانقلها إلى الطبق المطلي مقاس 10 سم. الثقافة في 37 °C ، 5٪ CO2 حاضنة لمدة 1 أسبوع.
    ملاحظة: في أول 7 أيام ، لا تحرك الطبق.
  13. انتعش باستخدام Medium B الطازج مرة واحدة في الأسبوع حتى اليوم 49 (طبق 15 مل / 10 سم) ، وافحص الخلايا تحت المجهر مرة واحدة في الأسبوع.
    ملاحظة: بعد اليوم 49 ، يمكن العثور على العديد من الخلايا الإفرازية في المادة الطافية في طبق الاستزراع.
  14. أجهزة الطرد المركزي الخلايا الطافية في 200 × غرام لمدة 5 دقائق في RT.
  15. قم بشفط المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الخلايا ب 2 مل من Medium B الطازج وانقلها إلى بئر جديد منخفض الالتصاق من 6 آبار. احتضان في حاضنة CO 5 ٪2 ، 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: في الأيام ال 7 القادمة ، لا تحرك اللوحة. يمكن أن تلتصق الخلايا الدبقية الصغيرة بقاع بئر الالتصاق المنخفض.
  16. في اليوم 56 ، استبدل ب Medium C (الجدول 1) (2 مل / بئر من لوحة 6 آبار). تلتصق الخلايا الدبقية الصغيرة بقاع بئر الالتصاق المنخفض وستبدو متفرعة تحت المجهر.
    ملاحظة: عن طريق تغيير الوسط C كل 3 أيام (2 مل / بئر من لوحة 6 آبار) ، يمكن زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في Medium C لمدة 15 يوما تقريبا.

2. توليد ROs البشرية والمشاركة في ثقافة ROs مع الخلايا الدبقية الصغيرة

  1. استزراع hESCs في وسط الخلايا الجذعية حتى تصل كثافة الخلية إلى 80٪ -90٪. بذر ما لا يقل عن 1 × 106 خلايا في كل بئر.
  2. أضف Dispase (1 مل / بئر من 6 ألواح بئر) إلى خلية الاستزراع. احتضان على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. نضح محلول Dispase من البئر.
  3. أضف الوسط D (الجدول 1) (1 مل / بئر من 6 ألواح بئر) إلى البئر. قطع الخلية إلى قطع صغيرة مع ماصة 10 ميكرولتر.
  4. اجمع برفق كل قطع الخلايا والمتوسطة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  5. أجهزة الطرد المركزي في 200 × غرام لمدة 5 دقائق وإزالة طاف.
  6. أعد تعليق الخلايا برفق في 200 ميكرولتر من المصفوفة الباردة. انقل أنبوب الطرد المركزي 1.5 إلى حاضنة لمدة 20 دقيقة. تعمل بسرعة لأن المصفوفة سوف تصلب في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد 20 دقيقة في الحاضنة ، سوف تصلب المصفوفة.
  7. تحضير طبق 10 سم مع 15 مل متوسط D. أعد تعليق المصفوفة ب Medium D ورج طبق بتري برفق.
  8. ثم ضع الطبق في حاضنة لمدة 5 أيام. لا تحرك اللوحة. حدد اليوم على أنه اليوم 0 (ROs). سوف تلتصق الخلايا في 3 أيام.
  9. في اليوم 5 (ROs) واليوم 10 (ROs) ، قم بتحديث الوسيط باستخدام Medium D.
  10. في اليوم 12 (ROs) ، قم بإزالة الوسط وإضافة 3 مل من Dispase إلى كل طبق لمدة 5 دقائق.
  11. نضح Dispase وإضافة 15 مل من متوسط E (الجدول 1).
  12. حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة: في اليوم 56 (MGs) ، قم بشفط الوسط C برفق ، وأضف Accutase (1 مل / بئر من صفيحة 6 آبار) ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  13. اجمع الخلايا الدبقية الصغيرة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل باستخدام ماصة سعة 5 مل. خلايا الطرد المركزي في 200 × غرام في RT لمدة 5 دقائق.
  14. قم بشفط المادة الطافية برفق وقم بتعليق الخلايا الدبقية الصغيرة ب 1 مل من Medium E. أضف الخلايا الدبقية الصغيرة إلى ROs المهضومة في اليوم 12.
    ملاحظة: في اليوم 12 (ROs) ، تكون الخلايا لاصقة. في اليوم 13 (ROs) ، تم العثور على الخلايا معلقة في Medium E. إذا تغير الوسط إلى اللون الأصفر من اليوم 12 (ROs) إلى اليوم 19 (ROs) ، فقم بتحديث الوسيط باستخدام Medium E.
  15. في اليوم 19 (ROs) ، قم بتجميع المواد العضوية في وسط الطبق عن طريق تدوير الطبق برفق. قم بشفط Medium E برفق وقم بتحديث الوسيط باستخدام Medium F.
  16. انقل المواد العضوية باستخدام Medium F إلى طبق تعليق جديد.
  17. قم بتغيير الوسيط مرة واحدة في الأسبوع وحدد المواد العضوية للتجارب.

النتائج

تم وصف الإجراء الخاص بتوليد عضويات الشبكية في دراستنا السابقة15. هنا ، نعرض النتائج التمثيلية للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة والعضوية الشبكية.

هنا ، نوضح كل مرحلة من مراحل تمايز الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1 أ). يمثل اليوم 0 ?...

Discussion

نظرا لمحدودية توافر شبكية العين البشرية ، فإن فهمنا الحالي للاستجابات الالتهابية للشبكية يأتي تقريبا من النماذج الحيوانية. للتغلب على هذا القيد ، تم تمييز عضويات الشبكية. كان تطوير نماذج الشبكية العضوية مجالا نشطا للبحث ، يهدف إلى تلخيص تعقيد شبكية العين البشرية لنمذجة المرض والتطوير ال...

Disclosures

لا يعلم المؤلفون بأي انتماءات أو عضوية أو منح أو حيازة مالية قد تؤثر على موضوعية هذه الدراسة.

Acknowledgements

هذه الدراسة مدعومة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82101145) ومؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (Z200014).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AcctuaseStemcell Technologies07920
Advanced DMEM/F12Thermo12634-010
Anti-CRX(M02)abnovaH00001406-M02Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1Abcamab5076Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27Life Technologies17105-041
Dispase (1U/mL)Stemcell Technologies07923
DMEM basicGibco10566-016
DMEM/F12Gibco10565-042
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
F12Gibco11765-054
FBSBiological Industry04-002-1A
GelatinSigmaG7041-100GSolid
GlutamaxGibco35050-061
H9 cell lineWiCell Research Institute
IL-3RD Systems 203-IL-050
IL-34PeproTech200-34-50UG
KSRGibco10828028
MatrixCorning356231
M-CSFRD Systems 216-MC-500 
MEM Non-essential Amino Acid SolutionSigmaM7145
N2Life Technologies17502-048
NeurobasalGibco21103-049
Pen/strepGibco15140-122
Stem cell medium Stemcell Technologies5990
TaurineSigmaT-8691-25G
X-ViVOLONZA04-418Q
Y27632SelleckS1049
β-mercaptoethanolLife Technologies21985-023

References

  1. Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
  2. Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
  3. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  4. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  5. Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
  6. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  7. O'koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
  8. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
  9. Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
  10. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
  11. Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
  12. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  13. Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
  14. Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
  15. Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
  16. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  17. Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
  18. Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved