Montagem de organoides retinianos com microglia

Resumo

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Resumo

Devido à acessibilidade limitada da retina humana, os organoides retinianos (ROs) são o melhor modelo para estudar doenças retinianas humanas, o que pode revelar o mecanismo de desenvolvimento da retina e a ocorrência de doenças retinianas. A microglia (MG) são macrófagos residentes únicos na retina e no sistema nervoso central (SNC), servindo a funções imunitárias cruciais. No entanto, os organoides retinianos carecem de micróglia, pois sua origem de diferenciação é o saco vitelino. A patogênese específica da microglia nessas doenças da retina permanece obscura; Portanto, o estabelecimento de um modelo organoide retiniano incorporado à microglia revela-se necessário. Aqui, construímos com sucesso um modelo co-cultivado de organoides retinianos com microglia derivada de células-tronco humanas. Neste artigo, diferenciamos a microglia e, em seguida, co-cultivamos em organoides retinianos no estágio inicial. Como incorporação de células imunes, este modelo fornece uma plataforma otimizada para modelagem de doenças da retina e triagem de medicamentos para facilitar pesquisas aprofundadas sobre a patogênese e o tratamento de doenças relacionadas à retina e ao SNC.

Introdução

Como fonte limitada da retina humana, a diferenciação de células-tronco humanas em organoides retinianos tridimensionais (3D) representa um modelo in vitro promissor para simular a retina¹. Ele contém diferentes tipos de células na retina, incluindo fotorreceptores, células ganglionares da retina, células bipolares, células de Müller, células horizontais e astrócitos². Este modelo permite a emulação e o estudo dos mecanismos de desenvolvimento da retina e da patogênese das doenças da retina. No entanto, devido ao método de diferenciação direcional, os organoides retinianos foram derivados do neuroectoderma

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. A linhagem celular H9 dos HESCs era do Instituto de Pesquisa WiCell. Pré-aqueça o meio de cultura celular à temperatura ambiente (RT) por 30 min antes do experimento.

1. Geração de micróglia humana

1. Cultive as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 10⁶ células em cada poço.
2. Aspire o meio de células-tronco e enxágue as células com 1x DPBS (1 mL / poço de placa de 6 poços). A próxima etapa requer 2 x 10^7-1 x 10....

Discussão

Devido à disponibilidade restrita da retina humana, nossa compreensão atual das respostas inflamatórias da retina vem quase de modelos animais. Para superar essa limitação, os organoides retinianos foram diferenciados. O desenvolvimento de modelos organoides retinianos tem sido uma área ativa de pesquisa, com o objetivo de recapitular a complexidade da retina humana para modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de organoides retinianos a partir de cél.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023