Montagem de organoides retinianos com microglia

Resumo

A microglia é uma célula imune residente única na retina, desempenhando papéis cruciais em várias doenças degenerativas da retina. A geração de um modelo de co-cultura de organoides retinianos com microglia pode facilitar uma melhor compreensão da patogênese e do progresso do desenvolvimento das doenças retinianas.

Resumo

Devido à acessibilidade limitada da retina humana, os organoides retinianos (ROs) são o melhor modelo para estudar doenças retinianas humanas, o que pode revelar o mecanismo de desenvolvimento da retina e a ocorrência de doenças retinianas. A microglia (MG) são macrófagos residentes únicos na retina e no sistema nervoso central (SNC), servindo a funções imunitárias cruciais. No entanto, os organoides retinianos carecem de micróglia, pois sua origem de diferenciação é o saco vitelino. A patogênese específica da microglia nessas doenças da retina permanece obscura; Portanto, o estabelecimento de um modelo organoide retiniano incorporado à microglia revela-se necessário. Aqui, construímos com sucesso um modelo co-cultivado de organoides retinianos com microglia derivada de células-tronco humanas. Neste artigo, diferenciamos a microglia e, em seguida, co-cultivamos em organoides retinianos no estágio inicial. Como incorporação de células imunes, este modelo fornece uma plataforma otimizada para modelagem de doenças da retina e triagem de medicamentos para facilitar pesquisas aprofundadas sobre a patogênese e o tratamento de doenças relacionadas à retina e ao SNC.

Introdução

Como fonte limitada da retina humana, a diferenciação de células-tronco humanas em organoides retinianos tridimensionais (3D) representa um modelo in vitro promissor para simular a retina¹. Ele contém diferentes tipos de células na retina, incluindo fotorreceptores, células ganglionares da retina, células bipolares, células de Müller, células horizontais e astrócitos². Este modelo permite a emulação e o estudo dos mecanismos de desenvolvimento da retina e da patogênese das doenças da retina. No entanto, devido ao método de diferenciação direcional, os organoides retinianos foram derivados do neuroectoderma³, faltando muitos outros tipos de células originárias de diferentes camadas germinativas, como a microglia do saco vitelino e as células perivasculares do mesoderma ^4,5,6.

Atualmente, muitas doenças da retina, como retinite pigmentosa⁷, glaucoma⁸ e retinoblastoma⁹, provaram estar intimamente relacionadas à microglia dentro da retina. No entanto, devido à falta de modelos de pesquisa adequados, mecanismos específicos que ilustram a relação entre a microglia e essas doenças ainda permanecem obscuros. Embora os camundongos tenham servido como um modelo favorável para o estudo de doenças da retina, estudos recentes destacaram diferenças significativas entre a microglia de camundongos e humanos em termos de expectativa de vida, taxa de proliferação e ausência de genes homólogos humanos^10,11. Essas descobertas sugeriram que as conclusões tiradas de modelos de camundongos podem não ser totalmente confiáveis, enfatizando a importância da construção de organoides retinianos humanos contendo microglia.

Nas últimas décadas, vários métodos para a diferenciação 3D de organoides retinianos foram desenvolvidos^12,13. Para facilitar a operação de co-cultura da microglia dentro dos organoides da retina, selecionamos um método de diferenciação envolvendo uma transição da cultura aderente para a cultura em suspensão. Essa abordagem permite que a microglia seja incorporada aos organoides da retina, mantendo-os por pelo menos 60 dias¹⁴.

Protocolo

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Institucional do Hospital Tongren de Pequim, Capital Medical University. A linhagem celular H9 dos HESCs era do Instituto de Pesquisa WiCell. Pré-aqueça o meio de cultura celular à temperatura ambiente (RT) por 30 min antes do experimento.

1. Geração de micróglia humana

1. Cultive as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 10⁶ células em cada poço.
2. Aspire o meio de células-tronco e enxágue as células com 1x DPBS (1 mL / poço de placa de 6 poços). A próxima etapa requer 2 x 10^7-1 x 10⁸ células. Se não for suficiente, combine células de 2 a 5 poços para executar as etapas a seguir.
3. Dissocie as colônias de células-tronco usando a solução de EDTA 0,5 mM por cerca de 5 min em uma incubadora a 37 ° C (1 mL / poço de placa de 6 poços).
4. Verifique a morfologia da colônia após 5 min. Quando as bordas da colônia estão ligeiramente enroladas com lacunas soltas, as células estão prontas para serem diferenciadas e aspirar o EDTA. Caso contrário, incube as células a 37 °C por mais 1-2 min. Não incube por mais de 8 min.
5. Enxágue suavemente as células em cada poço usando 6 mL de meio A (Tabela 1) com 6 μL de solução de inibidor de ROCK Y-27632 10 mM. Bata suavemente no fundo do prato para ajudar a enxaguar as células. Defina o dia como dia 0.
   NOTA: Não pipete as células. As células formarão corpos embrióides (EBs) no dia seguinte.
6. Após 24 h, observe as células ao microscópio para confirmar a formação de EB. Colete os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.
7. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda os EBs com 6 mL de Medium A fresco e transfira-os para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Cultura em incubadora a 37 °C.
   NOTA: O objetivo da transferência do poço no dia 1 é reduzir a influência de um grande número de células mortas durante o processo de formação de EB, o que pode afetar o estado de crescimento celular.
8. Atualize o Meio A fresco diariamente até o dia 4 (6 mL / poço de placa de 6 poços).
9. No dia 4, cubra uma placa de 10 cm com 3 mL de solução de gelatina de peixe a 0,1% por pelo menos 1 h em uma incubadora de CO₂ a 5% a 37 ° C.
   NOTA: Se o tempo de revestimento for inferior a 1 h, é difícil realizar as etapas a seguir.
10. Colete cuidadosamente os EBs em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 10 mL e espere que os EBs se assentem no fundo em 5 min.
11. Remova a solução de gelatina a 0,1% e enxágue o prato de 10 cm uma vez com 5-6 mL de 1x DPBS. Remova o DPBS.
12. Ressuspenda suavemente os EBs com 15 mL de Meio B (Tabela 1) no tubo centrífugo de 15 mL e transfira-os para o prato revestido de 10 cm. Cultura em incubadora a 37 °C, CO 5%₂ por 1 semana.
    NOTA: Nos primeiros 7 dias, não mova o prato.
13. Refresque com Medium B fresco uma vez por semana até o dia 49 (prato de 15 mL / 10 cm) e examine as células ao microscópio uma vez por semana.
    NOTA: Após o dia 49, várias células secretoras podem ser encontradas no sobrenadante na placa de cultura.
14. Centrifugar as células sobrenadantes a 200 x g durante 5 min a RT.
15. Aspire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda as células com 2 mL de meio B fresco e transfira para um novo poço de baixa adesão de placa de 6 poços. Incubar em uma incubadora de CO₂, 37 °C a 5%.
    NOTA: Nos próximos 7 dias, não mova a placa. A microglia pode aderir ao fundo do poço de baixa adesão.
16. No dia 56, substitua por Medium C (Tabela 1) (2 mL / poço de placa de 6 poços). A microglia adere ao fundo do poço de baixa adesão e parecerá ramificada ao microscópio.
    NOTA: Ao trocar o meio C a cada 3 dias (2 mL / poço de placa de 6 poços), a microglia pode ser cultivada em meio C por cerca de 15 dias.

2. Geração de ROs humanos e co-cultura dos ROs com microglia

1. Cultivei as hESCs em meio de células-tronco até que a densidade celular atinja 80%-90%. Semeie pelo menos 1 x 10⁶ células em cada poço.
2. Adicione Dispase (1 mL / poço de placa de 6 poços) à célula de cultura. Incubar a 37 °C durante 5 min. Aspire a solução Dispase do poço.
3. Adicione o Médio D (Tabela 1) (1 mL / poço de placa de 6 poços) ao poço. Corte a célula em pedaços pequenos com uma pipeta de 10 μL.
4. Recolha cuidadosamente todos os pedaços de células e meios num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
5. Centrifugue a 200 x g durante 5 min e retire o sobrenadante.
6. Ressuspenda suavemente as células em 200 μL de uma matriz fria. Mova o tubo de microcentrífuga de 1.5 para uma incubadora por 20 min. Opere rápido porque a matriz se solidificará à temperatura ambiente (RT). Após 20 minutos na incubadora, a matriz se solidificará.
7. Prepare uma placa de 10 cm com 15 mL de Medium D. Ressuspenda a matriz com Medium D e agite a placa de Petri suavemente.
8. Em seguida, coloque o prato em uma incubadora por 5 dias. Não mova a placa. Defina o dia como dia 0 (ROs). As células irão aderir em 3 dias.
9. No dia 5 (ROs) e no dia 10 (ROs), atualize o meio com Medium D.
10. No dia 12 (ROs), remova o meio e adicione 3 mL de Dispase a cada prato por 5 min.
11. Aspire o Dispase e adicione 15 mL de Medium E (Tabela 1).
12. Colheita da microglia: No dia 56 (MGs), aspire suavemente o Medium C, adicione Accutase (1 mL / poço de uma placa de 6 poços) e incube a 37 ° C por 3 min.
13. Colete as células da microglia em um tubo centrífugo de 15 mL com uma pipeta de 5 mL. Centrifugue as células a 200 x g em RT por 5 min.
14. Aspire suavemente o sobrenadante e suspenda a microglia com 1 mL de Medium E. Adicione microglia às ROs digeridas no dia 12.
    NOTA: No dia 12 (ROs), as células são adesivas. No dia 13 (ROs), as células são encontradas suspensas no meio E. Se o meio mudar de amarelo do dia 12 (ROs) para o dia 19 (ROs), atualize o meio com Medium E.
15. No dia 19 (ROs), agregue os organoides ao centro do prato, girando suavemente o prato. Aspire suavemente o Medium E e refresque o meio com Medium F.
16. Transfira os organoides com Medium F para um novo prato de suspensão.
17. Troque o meio uma vez por semana e selecione organoides para experimentos.

Resultados

O procedimento para geração de organoides retinianos é descrito em nosso estudo anterior¹⁵. Aqui, mostramos os resultados representativos da microglia e da co-cultura de microglia e organoides da retina.

Aqui, demonstramos cada estágio da diferenciação da microglia (Figura 1A). O dia 0 representa o estágio da cultura de células-tronco. Em seguida, as células-tronco foram digeridas e cultivadas para formação de EB. Nos primeiros 4...

Discussão

Devido à disponibilidade restrita da retina humana, nossa compreensão atual das respostas inflamatórias da retina vem quase de modelos animais. Para superar essa limitação, os organoides retinianos foram diferenciados. O desenvolvimento de modelos organoides retinianos tem sido uma área ativa de pesquisa, com o objetivo de recapitular a complexidade da retina humana para modelagem de doenças e desenvolvimento terapêutico. Vários estudos relataram a geração bem-sucedida de organoides retinianos a partir de cél...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023