Assemblaggio di organoidi retinici con microglia

Riepilogo

Le microglia sono cellule immunitarie uniche residenti nella retina, che svolgono un ruolo cruciale in varie malattie degenerative della retina. La generazione di un modello di co-coltura di organoidi retinici con microglia può facilitare una migliore comprensione della patogenesi e del progresso dello sviluppo delle malattie retiniche.

Abstract

A causa della limitata accessibilità della retina umana, gli organoidi retinici (RO) sono il miglior modello per lo studio della malattia retinica umana, che potrebbe rivelare il meccanismo dello sviluppo retinico e l'insorgenza della malattia retinica. Le microglia (MG) sono macrofagi residenti unici nella retina e nel sistema nervoso centrale (SNC) e svolgono funzioni immunitarie cruciali. Tuttavia, gli organoidi retinici mancano di microglia poiché la loro origine di differenziazione è il sacco vitellino. La patogenesi specifica della microglia in queste malattie della retina rimane poco chiara; Pertanto, la creazione di un modello di organoide retinico incorporato nella microglia risulta essere necessaria. Qui, abbiamo costruito con successo un modello co-coltivato di organoidi retinici con microglia derivate da cellule staminali umane. In questo articolo, abbiamo differenziato le microglia e poi le abbiamo co-coltivate con organoidi retinici nella fase iniziale. Come incorporazione di cellule immunitarie, questo modello fornisce una piattaforma ottimizzata per la modellazione delle malattie retiniche e lo screening dei farmaci per facilitare la ricerca approfondita sulla patogenesi e il trattamento delle malattie retiniche e correlate al SNC.

Introduzione

Essendo la fonte limitata della retina umana, la differenziazione delle cellule staminali umane in organoidi retinici tridimensionali (3D) rappresenta un promettente modello in vitro per la simulazione della retina¹. Contiene diversi tipi di cellule nella retina, tra cui fotorecettori, cellule gangliari retiniche, cellule bipolari, cellule di Müller, cellule orizzontali e astrociti². Questo modello consente l'emulazione e lo studio sia dei meccanismi di sviluppo retinico che della patogenesi delle malattie retiniche. Tuttavia, a causa del metodo di differenziazione direzionale, gli organoidi retinici sono stati ....

Protocollo

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale del Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. La linea cellulare H9 di HESC proveniva dal WiCell Research Institute. Preriscaldare il terreno di coltura cellulare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti prima dell'esperimento.

1. Generazione di microglia umane

1. Coltivare le hESC in terreno di coltura con cellule staminali fino a quando la densità cellulare raggiunge l'80%-90%. Seminare almeno 1 x 10⁶ celle in ogni pozzetto.
2. Aspirare il terreno di coltura delle cellule staminali e sciacquare le cellule con 1x DPBS (1 ....

Risultati

La procedura per generare organoidi retinici è descritta nel nostro precedente studio¹⁵. Qui, mostriamo i risultati rappresentativi della microglia e della co-coltura di microglia e organoidi retinici.

Qui, dimostriamo ogni fase della differenziazione della microglia (Figura 1A). Il giorno 0 rappresenta la fase della coltura delle cellule staminali. Quindi, le cellule staminali sono state digerite e coltivate per la formazione di EB. Nei p.......

Discussione

A causa della limitata disponibilità della retina umana, la nostra attuale comprensione delle risposte infiammatorie retiniche proviene quasi da modelli animali. Per superare questa limitazione, gli organoidi retinici sono stati differenziati. Lo sviluppo di modelli di organoidi retinici è stata un'area di ricerca attiva, con l'obiettivo di ricapitolare la complessità della retina umana per la modellazione delle malattie e lo sviluppo terapeutico. Diversi studi hanno riportato la generazione di organoidi retinici da c.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023