ミクログリアによる網膜オルガノイドの組み立て

要約

ミクログリアは、網膜に特異的に存在した免疫細胞であり、さまざまな網膜変性疾患において重要な役割を果たしています。網膜オルガノイドとミクログリアの共培養モデルを作成することで、網膜疾患の病因と発症の進行の理解を深めることができます。

要約

ヒトの網膜へのアクセスが限られているため、網膜オルガノイド(RO)はヒトの網膜疾患を研究するための最良のモデルであり、網膜の発達のメカニズムと網膜疾患の発生を明らかにする可能性があります。ミクログリア(MG)は、網膜および中枢神経系(CNS)に特異的に常在するマクロファージであり、重要な免疫機能を果たしています。しかし、レチナールオルガノイドは、分化の起源が卵黄嚢であるため、ミクログリアを欠いています。これらの網膜疾患におけるミクログリアの特異的な病因は不明のままです。したがって、ミクログリアに組み込まれた網膜オルガノイドモデルの確立が必要であることが判明しました。本研究では、ヒト幹細胞由来のミクログリアを用いたレチナールオルガノイドの共培養モデルの構築に成功しました。本稿では、ミクログリアを分化させた上で、初期段階で網膜オルガノイドに共培養しました。免疫細胞を組み込むこのモデルは、網膜疾患モデリングと薬物スクリーニングに最適化されたプラットフォームを提供し、網膜およびCNS関連疾患の病因と治療に関する詳細な研究を促進します。

概要

ヒト網膜の限られた供給源として、ヒト幹細胞の三次元(3D)網膜オルガノイドへの分化は、網膜¹をシミュレートするための有望なin vitroモデルを表しています。それは、光受容体、網膜神経節細胞、双極細胞、ミュラー細胞、水平細胞、および星状細胞²を含む、網膜内の異なる細胞タイプを含む。このモデルにより、網膜の発達メカニズムと網膜疾患の病因の両方をエミュレートし、研究することができます。しかし、方向性分化法により、網膜オルガノイドは神経外胚葉³に由来し、卵黄嚢のミクログリアや中胚葉の血管周囲細胞など、異なる胚葉に由来する他の多くの細胞型を欠いていました^4,5,6。

現在、網膜色素変性症⁷、緑内障⁸、網膜芽細胞腫⁹など、多くの網膜疾患が網膜内のミクログリアと密接に関連していることが証明されています。しかし、適切な研究モデルがないため、ミクログリアとこれらの疾患との関係を示す具体的なメカニズムはまだ....

プロトコル

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の制度倫理委員会によって承認されました。HESCs細胞株H9はWiCell Research Instituteに由来します。実験前に、細胞培養培地を室温(RT)で30分間予温します。

1. ヒトミクログリアの生成

1. 細胞密度が80%〜90%に達するまで、幹細胞培地でhESCを培養します。各ウェルに少なくとも1 x 10⁶ 個の細胞を播種します。
2. 幹細胞培地を吸引し、1x DPBS(1 mL/ウェル6ウェルプレート)で細胞をすすぎます。次の手順では、2 x 10^7-1 x 10⁸ セルが必要です。十分でない場合は、2〜5ウェルのセルを組み合わせて、次の手順を実行します。
3. 0.5 mM EDTA溶液を37 °Cインキュベーター(1 mL/ウェル6ウェルプレート)で約5分間使用して、幹細胞コロニーを解離します。
4. 5分後にコロニーの形態を確認します。コロニーの端がわずかに丸まって隙間が緩くなっている場合、細胞は分化してEDTAを吸引する準備ができています。そうでない場合は、細胞を37°Cでさらに1〜2分間インキュベートします。8分以上インキュベートしないでください。
5. 6 mLの培地A(表1)と6 μLの10 mM RO....

ディスカッション

ヒトの網膜の利用可能性が限られているため、網膜の炎症反応に関する現在の理解は、ほとんど動物モデルから来ています。この制限を克服するために、網膜オルガノイドを分化しました。網膜オルガノイドモデルの開発は、ヒトの網膜の複雑さを再現して疾患モデリングと治療法の開発に役立てることを目的とした活発な研究分野です。いくつかの研究で、ヒト多能性^{幹細胞<.......}

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023