Сборка органоидов сетчатки с микроглией

Резюме

Микроглия является уникальными резидентными иммунными клетками в сетчатке, играющими решающую роль в различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Создание модели совместного культивирования органоидов сетчатки с микроглией может способствовать лучшему пониманию патогенеза и прогресса развития заболеваний сетчатки.

Аннотация

Из-за ограниченной доступности сетчатки человека, органоиды сетчатки (РО) являются лучшей моделью для изучения заболеваний сетчатки человека, которые могут выявить механизм развития сетчатки и возникновение заболеваний сетчатки. Микроглия (МГ) — это уникальные резидентные макрофаги в сетчатке глаза и центральной нервной системе (ЦНС), выполняющие важнейшие иммунные функции. Тем не менее, органоиды сетчатки лишены микроглии, так как источником их дифференцировки является желточный мешок. Специфический патогенез микроглии при этих заболеваниях сетчатки остается неясным; Таким образом, создание модели органоида сетчатки, инкорпорированной в микроглию, оказывается необходимым. Здесь мы успешно построили совместно культивируемую модель органоидов сетчатки с микроглией, полученной из стволовых клеток человека. В этой статье мы дифференцировали микроглию, а затем совместно культивировали с органоидами сетчатки на ранней стадии. Поскольку эта модель включает в себя иммунные клетки, она обеспечивает оптимизированную платформу для моделирования заболеваний сетчатки и скрининга лекарственных препаратов для содействия углубленным исследованиям патогенеза и лечения заболеваний, связанных с сетчаткой и ЦНС.

Введение

Дифференцировка стволовых клеток человека в трехмерные (3D) органоиды сетчатки представляет собой многообещающую модель in vitro для моделирования сетчатки¹. Он содержит различные типы клеток сетчатки, включая фоторецепторы, ганглиозные клетки сетчатки, биполярные клетки, клетки Мюллера, горизонтальные клетки и астроциты². Эта модель позволяет имитировать и изучать как механизмы развития сетчатки, так и патогенез заболеваний сетчатки. Однако, благодаря методу направленной дифференцировки, органоиды сетчатки были получены из нейроэктодермы³, в то время как многие другие типы клеток происходят из других зародышевых слоев, таких как микроглия из желточного мешка и периваскулярные клетки из мезодермы ^4,5,6.

В настоящее время доказано, что многие заболевания сетчатки, такие как пигментный ретинит⁷, глаукома⁸ и ретинобластома⁹, тесно связаны с микроглией в сетчатке. Однако из-за отсутствия надлежащих исследовательских моделей конкретные механизмы, иллюстрирующие взаимосвязь между микроглией и этими заболеваниями, до сих пор остаются неясными. В то время как мыши послужили благоприятной моделью для изучения заболеваний сетчатки, недавние исследования выявили значительные различия между мышиной и человеческой микроглией с точки зрения продолжительности жизни, скорости пролиферации и отсутствия гомологичных^{генов человека.} Эти результаты свидетельствуют о том, что выводы, сделанные на основе мышиных моделей, могут быть не совсем надежными, что подчеркивает важность создания органоидов сетчатки человека, содержащих микроглию.

За последние несколько десятилетий были разработаны различные методы 3D-дифференцировки органоидов^{сетчатки12,13}. Чтобы облегчить кокультуральную операцию микроглии в органоидах сетчатки, мы выбрали метод дифференцировки, предполагающий переход от адгезивной культуры к суспензионной. Такой подход успешно позволяет встраивать микроглию в органоиды сетчатки, поддерживая их в течение как минимум 60 дней¹⁴.

протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по институциональной этике Пекинской больницы Тунжэнь Столичного медицинского университета. Клеточная линия H9 HESCs была получена из научно-исследовательского института WiCell. Предварительно подогрейте среду для культивирования клеток при комнатной температуре (ОТ) в течение 30 мин перед экспериментом.

1. Зарождение микроглии человека

1. Культивируйте hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х^{10 по 6} ячеек в каждую лунку.
2. Аспирируйте среду стволовых клеток и промойте клетки 1x DPBS (1 мл/лунка 6-луночного планшета). На следующем этапе требуется 2 x 10^7-1 x 10⁸ ячеек. Если недостаточно, объедините ячейки из 2-5 лунок, чтобы проделать следующие действия.
3. Диссоциируйте колонии стволовых клеток с помощью 0,5 мМ раствора ЭДТА в течение примерно 5 мин в инкубаторе при температуре 37 °C (1 мл/лунка 6-луночного планшета).
4. Проверьте морфологию колонии через 5 минут. Когда края колонии слегка скручиваются с рыхлыми промежутками, клетки готовы к дифференцировке и аспирации ЭДТА. Если нет, инкубируйте клетки при 37 °C еще 1-2 мин. Не выдерживайте дольше 8 минут.
5. Аккуратно промойте клетки в каждой лунке, используя 6 мл среды А (табл. 1) с 6 мкл 10 мл раствора ингибитора ROCK Y-27632. Аккуратно постучите по дну посуды, чтобы промыть клетки. Установите день как день 0.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не пипетируйте клетки. На следующий день клетки образуют эмбриоидные тельца (БЭ).
6. Через 24 ч понаблюдайте за клетками под микроскопом, чтобы подтвердить образование БЭ. Соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
7. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте БЭ 6 мл свежей среды А и перенесите их в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Выращивание в инкубаторе при температуре 37 °С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью пересадки лунки в 1-й день является снижение влияния большого количества мертвых клеток в процессе формирования БЭ, которые могут повлиять на состояние роста клеток.
8. Обновляйте свежую среду А ежедневно до 4-го дня (6 мл на лунку 6-луночного планшета).
9. На 4-й день обмажьте 10-сантиметровую чашку 3 мл 0,1% раствором рыбного желатина в течение не менее 1 ч в инкубаторе с 5% CO₂, 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если время нанесения покрытия составляет менее 1 часа, выполнить следующие действия сложно.
10. Осторожно соберите БЭ в центробежную пробирку объемом 15 мл с пипеткой объемом 10 мл и подождите, пока они осядут на дно через 5 минут.
11. Удалите 0,1% раствор желатина и ополосните 10-сантиметровую посуду один раз 5-6 мл 1x DPBS. Снимите DPBS.
12. Аккуратно суспендируйте EB с 15 мл Medium B (Таблица 1) в центробежной пробирке объемом 15 мл и переложите их в чашку с покрытием 10 см. Выращивание в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO₂ в течение 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В первые 7 дней не передвигайте посуду.
13. Освежайтесь свежим Medium B один раз в неделю до 49 дня (чашка 15 мл/10 см) и осматривайте клетки под микроскопом раз в неделю.
    Примечание: После 49-го дня несколько секреторных клеток могут быть обнаружены в надосадочной жидкости в чашке для культивирования.
14. Центрифугируйте надосадочные клетки при 200 x g в течение 5 мин при RT.
15. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки 2 мл свежей среды В и перенесите в новую лунку с низкой адгезией из 6-луночного планшета. Инкубировать в инкубаторе с 5%_CO2, 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В течение следующих 7 дней не перемещайте тарелку. Микроглия может прилипать к дну лунки с низкой адгезией.
16. На 56-й день замените на Medium C (Таблица 1) (2 мл/лунка 6-луночного планшета). Микроглия прилипает к дну колодца с низкой адгезией и под микроскопом будет выглядеть разветвленной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Меняя среду С каждые 3 дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета), микроглию можно культивировать в среде С в течение примерно 15 дней.

2. Генерация человеческих РО и совместное культивирование РО с микроглией

1. Культивировали hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х^{10 по 6} ячеек в каждую лунку.
2. Добавьте Disspase (1 мл/лунка 6-луночного планшета) в культуральную ячейку. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 5 минут. Отсасывайте раствор из скважины.
3. Добавьте в лунку Medium D (Таблица 1) (1 мл/лунка 6-луночного планшета). Разрежьте ячейку на небольшие кусочки с помощью пипетки объемом 10 μл.
4. Аккуратно соберите все кусочки клеток и среду в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
5. Центрифугируйте при 200 х г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость.
6. Аккуратно ресуспендируйте клетки в 200 мкл холодной матрицы. Переместите микроцентрифужную пробирку 1,5 в инкубатор на 20 минут. Работайте быстро, так как матрица затвердевает при комнатной температуре (RT). После 20 мин в инкубаторе матрица застынет.
7. Приготовьте чашку диаметром 10 см с 15 мл Medium D. Суспендируйте матрицу с Medium D и слегка встряхните чашку Петри.
8. Затем, поместите блюдо в инкубатор на 5 дней. Не перемещайте пластину. Установите день как день 0 (ROs). Клетки прилипнут через 3 дня.
9. На 5-й день (ROs) и 10-й день (ROs) обновите среду с помощью Medium D.
10. На 12-й день (ROs) удалите среду и добавьте по 3 мл Dispase в каждую чашку на 5 минут.
11. Отсадите диспазу и добавьте 15 мл среды Е (табл. 1).
12. Сбор микроглии: На 56-й день (MGs) осторожно аспирируйте среду C, добавьте Accutase (1 мл на лунку 6-луночного планшета) и инкубируйте при 37 °C в течение 3 минут.
13. Соберите клетки микроглии в центробежную пробирку объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 5 мл. Центрифугируйте ячейки при 200 x g при RT в течение 5 мин.
14. Аккуратно аспирируйте надосадочную жидкость и суспендируйте микроглию с 1 мл Medium E. Добавьте микроглию к переваренным RO на 12-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На 12-й день (ROs) клетки адгезивные. На 13-й день (ROs) клетки обнаруживаются суспензионными в среде Е. Если среда меняет желтый цвет с 12-го дня (ROs) на 19-й день (ROs), обновите среду с помощью среды E.
15. На 19-й день (ROs) смешайте органоиды в центр блюда, осторожно поворачивая тарелку. Аккуратно аспирируйте Medium E и освежите среду Medium F.
16. Переложите органоиды со Medium F в новую суспензию.
17. Меняйте среду раз в неделю и подбирайте органоиды для экспериментов.

Результаты

Процедура генерации органоидов сетчатки описана в нашем предыдущем исследовании¹⁵. Здесь мы показываем репрезентативные результаты микроглии и ко-культуры микроглии и органоидов сетчатки.

Здесь мы демонстрируем каждый этап дифференцировки микроглии (

Обсуждение

Из-за ограниченной доступности сетчатки глаза человека наше нынешнее понимание воспалительных реакций сетчатки почти основано на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, были дифференцированы органоиды сетчатки. Разработка моделей органоидов сетчатки является активной ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023