Сборка органоидов сетчатки с микроглией

Резюме

Микроглия является уникальными резидентными иммунными клетками в сетчатке, играющими решающую роль в различных дегенеративных заболеваниях сетчатки. Создание модели совместного культивирования органоидов сетчатки с микроглией может способствовать лучшему пониманию патогенеза и прогресса развития заболеваний сетчатки.

Аннотация

Из-за ограниченной доступности сетчатки человека, органоиды сетчатки (РО) являются лучшей моделью для изучения заболеваний сетчатки человека, которые могут выявить механизм развития сетчатки и возникновение заболеваний сетчатки. Микроглия (МГ) — это уникальные резидентные макрофаги в сетчатке глаза и центральной нервной системе (ЦНС), выполняющие важнейшие иммунные функции. Тем не менее, органоиды сетчатки лишены микроглии, так как источником их дифференцировки является желточный мешок. Специфический патогенез микроглии при этих заболеваниях сетчатки остается неясным; Таким образом, создание модели органоида сетчатки, инкорпорированной в микроглию, оказывается необходимым. Здесь мы успешно построили совместно культивируемую модель органоидов сетчатки с микроглией, полученной из стволовых клеток человека. В этой статье мы дифференцировали микроглию, а затем совместно культивировали с органоидами сетчатки на ранней стадии. Поскольку эта модель включает в себя иммунные клетки, она обеспечивает оптимизированную платформу для моделирования заболеваний сетчатки и скрининга лекарственных препаратов для содействия углубленным исследованиям патогенеза и лечения заболеваний, связанных с сетчаткой и ЦНС.

Введение

Дифференцировка стволовых клеток человека в трехмерные (3D) органоиды сетчатки представляет собой многообещающую модель in vitro для моделирования сетчатки¹. Он содержит различные типы клеток сетчатки, включая фоторецепторы, ганглиозные клетки сетчатки, биполярные клетки, клетки Мюллера, горизонтальные клетки и астроциты². Эта модель позволяет имитировать и изучать как механизмы развития сетчатки, так и патогенез заболеваний сетчатки. Однако, благодаря методу направленной дифференцировки, органоиды сетчатки были получены из нейроэктодермы³, в то время как многие другие типы клеток происхо....

протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по институциональной этике Пекинской больницы Тунжэнь Столичного медицинского университета. Клеточная линия H9 HESCs была получена из научно-исследовательского института WiCell. Предварительно подогрейте среду для культивирования клеток при комнатной температуре (ОТ) в течение 30 мин перед экспериментом.

1. Зарождение микроглии человека

1. Культивируйте hESCs в среде стволовых клеток до тех пор, пока плотность клеток не достигнет 80%-90%. Засейте не менее 1 х^{10 по 6} ячеек в каждую лунку.
2. Аспирируйте среду стволовых клеток и промойте клетки 1x DPBS (1 мл....

Результаты

Процедура генерации органоидов сетчатки описана в нашем предыдущем исследовании¹⁵. Здесь мы показываем репрезентативные результаты микроглии и ко-культуры микроглии и органоидов сетчатки.

Здесь мы демонстрируем каждый этап дифференцировки микроглии (

Обсуждение

Из-за ограниченной доступности сетчатки глаза человека наше нынешнее понимание воспалительных реакций сетчатки почти основано на животных моделях. Чтобы преодолеть это ограничение, были дифференцированы органоиды сетчатки. Разработка моделей органоидов сетчатки является активной ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023