用小胶质细胞组装视网膜类器官

摘要

小胶质细胞是视网膜中独特的常驻免疫细胞，在各种视网膜退行性疾病中起着至关重要的作用。生成视网膜类器官与小胶质细胞的共培养模型有助于更好地了解视网膜疾病的发病机制和发展进展。

摘要

由于人类视网膜的可及性有限，视网膜类器官 （ROs） 是研究人类视网膜疾病的最佳模型，它可以揭示视网膜发育的机制和视网膜疾病的发生。小胶质细胞 （MG） 是视网膜和中枢神经系统 （CNS） 中独特的常驻巨噬细胞，发挥着关键的免疫功能。然而，视网膜类器官缺乏小胶质细胞，因为它们的分化起点是卵黄囊。这些视网膜疾病中小胶质细胞的具体发病机制尚不清楚;因此，建立小胶质细胞掺入的视网膜类器官模型是必要的。在这里，我们成功地构建了视网膜类器官与来自人类干细胞的小胶质细胞的共培养模型。在本文中，我们区分了小胶质细胞，然后在早期共培养为视网膜类器官。作为免疫细胞的结合，该模型为视网膜疾病建模和药物筛选提供了一个优化的平台，以促进对视网膜和 CNS 相关疾病的发病机制和治疗的深入研究。

引言

作为人类视网膜的有限来源，人类干细胞分化为三维 （3D） 视网膜类器官代表了一种很有前途的模拟视网膜¹ 的体外模型。它在视网膜中包含不同的细胞类型，包括光感受器、视网膜神经节细胞、双极细胞、Müller 细胞、水平细胞和星形胶质细胞²。该模型能够模拟和研究视网膜发育机制和视网膜疾病的发病机制。然而，由于定向分化方法，视网膜类器官来源于神经外胚层³，缺乏许多其他源自不同胚层的细胞类型，例如来自卵黄囊的小胶质细胞和来自中胚层的血管周围细胞 ^4,5,6。

目前，许多视网膜疾病，如视网膜色素变性⁷、青光眼⁸ 和视网膜母细胞瘤⁹，已被证明与视网膜内的小胶质细胞密切相关。然而，由于缺乏适当的研究模型，说明小胶质细胞与这些疾病之间关系的具体机制仍不清楚。虽然小鼠是研究视网膜疾病的有利模型，但最近的研究强调了小鼠和人类小胶质细胞在寿命、增殖速率和人类同源基因缺失方面的显著差异

研究方案

本研究获得首都医科大学北京同仁医院机构伦理委员会批准。HESC 细胞系 H9 来自 WiCell 研究所。实验前在室温 （RT） 下预热细胞培养基 30 分钟。

1. 人类小胶质细胞的产生

1. 在干细胞培养基中培养 hESCs，直到细胞密度达到 80%-90%。在每个孔中接种至少 1 x 10⁶ 个细胞。
2. 吸出干细胞培养基并用 1x DPBS（1 mL/孔的 6 孔板）冲洗细胞。下一步需要 2 x 10^7-1 x 10⁸ 个细胞。如果不够，请合并 2-5 个孔的细胞以执行以下步骤。
3. 使用 0.5 mM EDTA 溶液在 37 °C 培养箱（1 mL/孔的 6 孔板）中解离干细胞集落约 5 分钟。
4. 5 分钟后检查菌落形态。当集落边缘略微卷曲并出现松散的间隙时，细胞就可以分化并吸出 EDTA。如果没有，请将细胞在 37 °C 下再孵育 1-2 分钟。孵育时间不要超过 8 分钟。
5. 使用 6 mL 培养基 A（表 1）和 6 μL 10 mM ROCK 抑制剂 Y-27632 溶液轻轻冲洗每个孔中的细胞。轻轻敲击培养皿底部以帮助冲洗细胞。将日期设置为第 0 天。
   注意：不要移液细胞。细胞将在第二天形成胚状体 （EB）。
6. 24 小时后....

讨论

由于人类视网膜的可用性有限，我们目前对视网膜炎症反应的理解几乎来自动物模型。为了克服这一限制，对视网膜类器官进行了分化。视网膜类器官模型的开发一直是一个活跃的研究领域，旨在概括人类视网膜的复杂性，用于疾病建模和治疗开发。几项研究报道了从人类多能干细胞中成功生成视网膜类器官 1,2,12,13。.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023