Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

Özet

Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Özet

İnsan retinasının sınırlı erişilebilirliği nedeniyle, retina organoidleri (RO'lar), retina gelişim mekanizmasını ve retina hastalığının oluşumunu ortaya çıkarabilecek insan retina hastalığını incelemek için en iyi modeldir. Mikroglia (MG), retina ve merkezi sinir sisteminde (MSS) benzersiz yerleşik makrofajlardır ve önemli bağışıklık fonksiyonlarına hizmet eder. Bununla birlikte, retinal organoidler, farklılaşma kökenleri yumurta sarısı kesesi olduğu için mikrogliadan yoksundur. Bu retina hastalıklarında mikroglianın spesifik patogenezi belirsizliğini korumaktadır; Bu nedenle, mikroglia içeren bir retinal organoid modelinin kurulmasının gerekli olduğu ortaya çıkmaktadır. Burada, insan kök hücrelerinden türetilen mikroglia ile birlikte kültürlenmiş bir retinal organoid modelini başarıyla oluşturduk. Bu makalede, mikroglia ayrımı yapıldı ve daha sonra erken evrede retinal organoidlerle birlikte kültürlendi. Bağışıklık hücrelerinin dahil edilmesi olarak bu model, retina ve CNS ile ilişkili hastalıkların patogenezi ve tedavisi hakkında derinlemesine araştırmaları kolaylaştırmak için retina hastalığı modellemesi ve ilaç taraması için optimize edilmiş bir platform sağlar.

Giriş

İnsan retinasının sınırlı kaynağı olarak, insan kök hücrelerinin üç boyutlu (3D) retinal organoidlere farklılaşması, retinayı simüle etmek için umut verici bir in vitro modeli temsil eder¹. Retinada fotoreseptörler, retinal ganglion hücreleri, bipolar hücreler, Müller hücreleri, yatay hücreler ve astrositler² dahil olmak üzere farklı hücre tipleri içerir. Bu model, hem retina gelişim mekanizmalarının hem de retina hastalıklarının patogenezinin öykünmesini ve incelenmesini sağlar. Bununla birlikte, yönlü farklılaşma yöntemi nedeniyle, retinal organoidler, yolk kesesinden mikroglia ve mezodermden perivasküler hücreler gibi farklı germ katmanlarından kaynaklanan diğer birçok hücre tipinden yoksun olan nöroektoderm^3'ten türetilmiştir ^4,5,6.

Şu anda, retinitis pigmentosa⁷, glokom⁸ ve retinoblastoma⁹ gibi birçok retina hastalığının retinadaki mikroglia ile yakından ilişkili olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, uygun araştırma modellerinin olmaması nedeniyle, mikroglia ile bu hastalıklar arasındaki ilişkiyi gösteren spesifik mekanizmalar hala belirsizliğini korumaktadır. Fareler retina hastalıklarını incelemek için uygun bir model olarak hizmet ederken, son çalışmalar fare ve insan mikrogliası arasında yaşam süresi, proliferasyon oranı ve insan homolog genlerinin yokluğu açısından önemli farklılıklar olduğunu vurgulamıştır^10,11. Bu bulgular, fare modellerinden elde edilen sonuçların tamamen güvenilir olmayabileceğini ve mikroglia içeren insan retinal organoidlerinin oluşturulmasının önemini vurguladığını öne sürdü.

Son birkaç on yılda, retinal organoidlerin 3 boyutlu farklılaşması için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir^12,13. Retinal organoidler içinde mikroglia'nın ko-kültür çalışmasını kolaylaştırmak için, yapışık kültürden süspansiyon kültürüne geçişi içeren bir farklılaşma yöntemi seçtik. Bu yaklaşım, mikroglia'nın retinal organoidlere başarılı bir şekilde dahil edilmesini ve en az 60 gün boyunca korunmasını sağlar¹⁴.

Protokol

Bu çalışma, Capital Medical Üniversitesi, Pekin Tongren Hastanesi Kurumsal Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır. HESC'nin hücre hattı H9, WiCell Araştırma Enstitüsü'ndendi. Deneyden önce hücre kültürü ortamını oda sıcaklığında (RT) 30 dakika önceden ısıtın.

1. İnsan mikrogliasının oluşumu

1. Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürleyin. Her kuyucuğa en az 1 x 10⁶ hücre tohumlayın.
2. Kök hücre ortamını aspire edin ve hücreleri 1x DPBS (1 mL / 6 oyuklu plakanın oyuğu) ile durulayın. Bir sonraki adım 2 x 10^7-1 x 10⁸ hücre gerektirir. Yeterli değilse, aşağıdaki adımları uygulamak için 2-5 kuyucuklu hücreleri birleştirin.
3. 37 ° C'lik bir inkübatörde (1 mL / 6 oyuklu plakanın 1 mL / oyuğu) yaklaşık 5 dakika boyunca 0.5 mM EDTA çözeltisini kullanarak kök hücre kolonilerini ayırın.
4. 5 dakika sonra koloni morfolojisini kontrol edin. Koloni kenarları gevşek boşluklarla hafifçe kıvrıldığında, hücreler farklılaşmaya ve EDTA'yı aspire etmeye hazırdır. Değilse, hücreleri 37 ° C'de 1-2 dakika daha inkübe edin. 8 dakikadan daha uzun süre kuluçkaya yatırmayın.
5. 6 μL 10 mM ROCK inhibitörü Y-27632 çözeltisi ile 6 mL Ortam A (Tablo 1) kullanarak her bir oyuktaki hücreleri nazikçe durulayın. Hücreleri durulamaya yardımcı olmak için tabağın altına hafifçe vurun. Günü 0. gün olarak ayarlayın.
   NOT: Hücreleri pipetlemeyin. Hücreler ertesi gün embriyoid cisimcikleri (EB'ler) oluşturacaktır.
6. 24 saat sonra, EB oluşumunu doğrulamak için hücreleri mikroskop altında gözlemleyin. EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.
7. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve EB'leri 6 mL taze Ortam A ile yeniden süspanse edin ve bunları 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. 37 °C'lik bir inkübatörde kültür.
   NOT: 1. günde kuyu transferinin amacı, EB oluşumu sürecinde hücre büyümesinin durumunu etkileyebilecek çok sayıda ölü hücrenin etkisini azaltmaktır.
8. Taze Orta A'yı 4. güne kadar her gün yenileyin (6 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu).
9. 4. günde, 10 cm'lik bir tabağı% 5 CO₂, 37 ° C'lik bir inkübatörde en az 1 saat boyunca 3 mL% 0.1 balık jelatin çözeltisi ile kaplayın.
   NOT: Kaplama süresi 1 saatten az ise, aşağıdaki adımların gerçekleştirilmesi zordur.
10. EB'leri 10 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe dikkatlice toplayın ve EB'lerin 5 dakika içinde dibe çökmesini bekleyin.
11. % 0.1 jelatin çözeltisini çıkarın ve 10 cm'lik kabı 5-6 mL 1x DPBS ile bir kez durulayın. DPBS'yi çıkarın.
12. EB'leri 15 mL santrifüj tüpte 15 mL Orta B (Tablo 1) ile nazikçe yeniden süspanse edin ve bunları kaplanmış 10 cm'lik tabağa aktarın. 1 hafta boyunca 37 ° C,% 5 CO₂ inkübatörde kültür.
    NOT: İlk 7 gün içinde tabağı hareket ettirmeyin.
13. 49. güne kadar (15 mL / 10 cm tabak) haftada bir kez taze Orta B ile yenileyin ve hücreleri haftada bir kez mikroskop altında inceleyin.
    NOT: 49. günden sonra, kültür kabındaki süpernatantta birkaç salgı hücresi bulunabilir.
14. Süpernatan hücreleri RT'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
15. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücreleri 2 mL taze Orta B ile yeniden süspanse edin ve 6 oyuklu plakadan oluşan yeni bir düşük yapışma kuyusuna aktarın. % 5 CO₂, 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin.
    NOT: Önümüzdeki 7 gün içinde plakayı hareket ettirmeyin. Mikroglia, düşük yapışma kuyusunun dibine yapışabilir.
16. 56. günde, Orta C (Tablo 1) (2 mL / 6 oyuklu plaka) ile değiştirin. Mikroglia, düşük yapışma özelliğinin dibine iyi yapışır ve mikroskop altında dallanmış görünecektir.
    NOT: Orta C'yi her 3 günde bir değiştirerek (2 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu), mikroglia yaklaşık 15 gün boyunca Orta C'de yetiştirilebilir.

2. İnsan RO'larının üretilmesi ve RO'ların mikroglia ile birlikte kültürlenmesi

1. Hücre yoğunluğu %80-90'a ulaşana kadar hESC'leri kök hücre ortamında kültürledi. Her kuyucuğa en az 1 x 10⁶ hücre tohumlayın.
2. Kültür hücresine Dispase (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. 37 °C'de 5 dakika inkübe edin. Dispase çözeltisini kuyudan aspire edin.
3. Kuyuya Orta D (Tablo 1) (1 mL / 6 oyuklu plakanın kuyusu) ekleyin. Hücreyi 10 μL'lik bir pipetle küçük parçalar halinde kesin.
4. Tüm hücre parçalarını ve ortamı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde nazikçe toplayın.
5. 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
6. Hücreleri 200 μL soğuk matriste nazikçe yeniden süspanse edin. 1.5 mikrosantrifüj tüpünü 20 dakika boyunca bir inkübatöre taşıyın. Matris oda sıcaklığında (RT) katılaşacağı için hızlı çalışın. İnkübatörde 20 dakika sonra, matris katılaşacaktır.
7. 15 mL Orta D ile 10 cm'lik bir tabak hazırlayın. Orta D ile Matrisi tekrar süspanse edin ve Petri kabını hafifçe sallayın.
8. Ardından, çanağı 5 gün boyunca bir kuluçka makinesine koyun. Plakayı hareket ettirmeyin. Günü 0. gün (RO) olarak ayarlayın. Hücreler 3 gün içinde yapışacaktır.
9. 5. günde (RO'lar) ve 10. günde (RO'lar), ortamı Orta D ile yenileyin.
10. 12. günde (RO'lar), ortamı çıkarın ve her yemeğe 5 dakika boyunca 3 mL Dispase ekleyin.
11. Dispase'ı aspire edin ve 15 mL Orta E ekleyin (Tablo 1).
12. Mikroglia hasadı: 56. günde (MG'ler), Orta C'yi nazikçe aspire edin, Accutase (6 oyuklu bir plakanın 1 mL / oyuğu) ekleyin ve 37 ° C'de 3 dakika inkübe edin.
13. Mikroglia hücrelerini 5 mL'lik bir pipet ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpe toplayın. Hücreleri RT'de 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
14. Süpernatanı nazikçe aspire edin ve mikrogliayı 1 mL Orta E ile askıya alın. 12. günde sindirilmiş RO'lara mikroglia ekleyin.
    NOT: 12. günde (RO'lar), hücreler yapışkandır. 13. günde (RO'lar), hücreler Orta E'de asılı olarak bulunur. Ortam, 12. günden (RO'lar) 19. güne (RO'lar) sarıya dönerse, ortamı Orta E ile yenileyin.
15. 19. günde (RO'lar), plakayı hafifçe döndürerek organoidleri yemeğin ortasına toplayın. Medium E'yi nazikçe aspire edin ve medium'u Medium F ile yenileyin.
16. Orta F ile organoidleri yeni bir süspansiyon kabına aktarın.
17. Ortamı haftada bir kez değiştirin ve deneyler için organoidleri seçin.

Sonuçlar

Retinal organoidler üretme prosedürü önceki çalışmamızda^{açıklanmıştır 15}. Burada, mikroglia ve ko-kültür mikroglia ve retinal organoidlerin temsili sonuçlarını gösteriyoruz.

Burada, mikroglia farklılaşmasının her aşamasını gösteriyoruz (Şekil 1A). 0. gün, kök hücre kültürünün aşamasını temsil eder. Daha sonra kök hücreler sindirildi ve EB oluşumu için kültürlendi. İşlemin ilk 4 gününde hücrel...

Tartışmalar

İnsan retinasının sınırlı mevcudiyeti nedeniyle, retinal inflamatuar yanıtların mevcut anlayışı neredeyse hayvan modellerinden gelmektedir. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için retinal organoidler farklılaştırıldı. Retinal organoid modellerin geliştirilmesi, hastalık modellemesi ve terapötik gelişim için insan retinasının karmaşıklığını özetlemeyi amaçlayan aktif bir araştırma alanı olmuştur. Birkaç çalışma, insan pluripotent kök hücrelerinden^başarılı

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acctuase	Stemcell Technologies	07920
Advanced DMEM/F12	Thermo	12634-010
Anti-CRX(M02)	abnova	H00001406-M02	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
Anti-IBA1	Abcam	ab5076	Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions
B27	Life Technologies	17105-041
Dispase (1U/mL)	Stemcell Technologies	07923
DMEM basic	Gibco	10566-016
DMEM/F12	Gibco	10565-042
DPBS	Gibco	C141905005BT
EDTA	Thermo	15575020
F12	Gibco	11765-054
FBS	Biological Industry	04-002-1A
Gelatin	Sigma	G7041-100G	Solid
Glutamax	Gibco	35050-061
H9 cell line	WiCell Research Institute
IL-3	RD Systems	203-IL-050
IL-34	PeproTech	200-34-50UG
KSR	Gibco	10828028
Matrix	Corning	356231
M-CSF	RD Systems	216-MC-500
MEM Non-essential Amino Acid Solution	Sigma	M7145
N2	Life Technologies	17502-048
Neurobasal	Gibco	21103-049
Pen/strep	Gibco	15140-122
Stem cell medium	Stemcell Technologies	5990
Taurine	Sigma	T-8691-25G
X-ViVO	LONZA	04-418Q
Y27632	Selleck	S1049
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985-023