A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

استخدمنا تلطيخ تكاثر الخلايا لتحديد الخلايا الهادئة في نموذج سرطان الدم الليمفاوي الحاد T-zebrafish. يتم الاحتفاظ بالبقعة في الخلايا غير المنقسمة وتقليلها أثناء تكاثر الخلايا ، مما يتيح اختيار الخلايا الخاملة لمزيد من الاستجواب. يوفر هذا البروتوكول أداة وظيفية لدراسة التجديد الذاتي في سياق السكون الخلوي.

Abstract

السكون الخلوي هو حالة توقف النمو أو تباطؤ الانتشار الموصوف في الخلايا الجذعية الطبيعية والسرطانية (CSCs). قد يحمي الهدوء الخلايا الجذعية السرطانية من أدوية العلاج الكيميائي المضادة للتكاثر. في نماذج الفئران المصابة بابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) المشتقة من المريض (PDX) ، ترتبط الخلايا الهادئة بمقاومة العلاج والجذع. أصباغ تكاثر الخلايا هي أدوات شائعة لتتبع انقسام الخلايا. ترتكز صبغة الفلورسنت تساهميا في مجموعات الأمين على الغشاء والجزيئات الكبيرة داخل الخلية. يسمح هذا بتتبع الخلايا المصنفة لما يصل إلى 10 أقسام ، والتي يمكن حلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

في النهاية ، سيكون للخلايا ذات أعلى معدلات الانتشار احتفاظ منخفض بالصبغة ، حيث سيتم تخفيفها مع كل انقسام خلوي ، في حين أن الخلايا الخاملة ذات الانقسام البطيء سيكون لها أعلى احتفاظ. تم تحسين استخدام أصباغ تكاثر الخلايا لعزل الخلايا الخاملة ووصفها في نماذج الماوس T-ALL. استكمالا لنماذج الفئران الحالية ، يوفر نموذج T-ALL المشتق من rag2: Myc مكانا ممتازا لاستجواب التجديد الذاتي في T-ALL بسبب التردد العالي للخلايا الجذعية اللوكيمية (LSCs) وراحة الزرد لتجارب الزرع واسعة النطاق.

هنا ، نصف سير العمل لتلطيخ خلايا الزرد T-ALL بصبغة تكاثر الخلايا ، وتحسين تركيز الصبغة لخلايا الزرد ، وتمرير الخلايا الملطخة بنجاح في الجسم الحي ، وجمع الخلايا بمستويات متفاوتة من الاحتفاظ بالصبغة عن طريق فرز الخلايا الحية من المزروعة. نظرا لعدم وجود صانعي أسطح خلايا راسخين ل LSCs في T-ALL ، يوفر هذا النهج وسيلة وظيفية لاستجواب الخلايا الهادئة في الجسم الحي. للحصول على نتائج تمثيلية ، نصف كفاءة النقش وتردد LSC للخلايا ذات الاحتفاظ بالصبغة العالية والمنخفضة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقق من الخصائص الإضافية للخلايا الهادئة ، بما في ذلك الاستجابة للأدوية ، وملفات تعريف النسخ ، والتشكل.

Introduction

الخلايا الجذعية البالغة هي المسؤولة عن تجديد أنواع الخلايا المتمايزة في عضو معين وهي موجودة في الغالب في حالة نائمة وغير مقسمة 1,2. على سبيل المثال ، تظل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، التي تحافظ على الدم ، هادئة إلى حد كبير ، ولا يدخل سوى جزء صغير دورة الخلية للتجديد الذاتي أو التمايز لتوليد مكونات دم ناضجة3. وبالمثل ، في السرطانات ، تمتلك مجموعة فرعية نادرة من الخلايا تسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) القدرة على التجديد الذاتي وهي مسؤولة عن الحفاظ على الورم الخبيث على المدى الطويل4. توجد الخلايا الجذعية السرطانية

Protocol

في هذا البروتوكول ، نستخدم خلايا T-ALL التي تحمل علامة GFP والتي تم إنشاؤها مسبقا في سلالة CG1 وبالتالي يمكن حقنها مباشرة في الزرد CG1 المتلقي15. باختصار ، تم إنشاء سرطان الدم عن طريق الحقن المجهري للحمض النووي من rag2: Myc و rag2: GFP في أجنة الزرد CG1 أحادية الخلية. تمت مراقبة لتطور سرطان الدم بدءا من 3 أسابيع بعد الحقن ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تم عزل خلايا ابيضاض الدم الإيجابية ل GFP FACS وزرعها بشكل متسلسل في سمك الزرد CG1 المتلقي لتوليد استنساخ بتردد عال من LSC. تم وصف تفاصيل البروتوكول بأكمله بواسطة Blackburn et al.15.

بدلا من ....

النتائج

لقد اتبعنا البروتوكول الموصوف أعلاه لفرز الخلايا التي احتفظت بصبغة تكاثر الخلايا ، CT-FR ، واستخدمناها لمقايسة التخفيف المحدد (LDA) لتقدير تردد LSC في مجموعات CT-FR العالية و CT-FR المنخفضة. لضبط البوابة لتجربة قياس التدفق الخلوي ، استخدمنا عنصر تحكم بدون فلوروفور (بدون لون) بالإض.......

Discussion

من المعروف أن LSCs مقاومة للعلاجات الكيميائية التقليدية المضادة للتكاثر ، وإيجاد علاجات مستهدفة ضد هذه الخلايا يحمل وعدا كبيرا في الحد من حدوث الانتكاس وتحسين تشخيص المريض20. وصفت الأبحاث السابقة استخدام بقع تكاثر الخلايا الفلورية لتحديد مجموعة صغيرة من الخ?.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم توفير التمويل لهذا البحث من قبل المعهد الوطني للسرطان (R37CA227656 إلى JSB). تم دعم هذا البحث أيضا من قبل الموارد المشتركة لقياس التدفق الخلوي ومراقبة المناعة لمركز السرطان بجامعة كنتاكي ماركي (P30CA177558).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
26 G/2” micro-syringeHamilton87930NA
35 µm filter cap FACS tubesFalcon352235NA
40 µm cell strainerCELLTREAT229482NA
96-well skirted PCR plateThermo Fisher ScientificAB0800NA
Cell sorterSony BiotechnologySY3200NA
CellTrace Far RedThermo Fisher ScientificC34564NA
Conical tubesVWR10026-078NA
DAPIThermo Fisher Scientific62248NA
DMSOSigma-AldrichD4818NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)Caisson Labs22110001NA
Epifluorescence stereo microscopeNikonSMZ25NA
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-Aldrich12306CNA
Fish system waterN/AN/A0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubesThermo Fisher ScientificC2171NA
MS-222PentaireTRS-1tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishesCorning07-202-011NA
Razor bladesAmerican Line66-0089NA
Trypan BlueThermo Fisher ScientificT10282NA

References

  1. Reya, T., Morrison, S. J., Clarke, M. F., Weissman, I. L. Stem cells, cancer, and cancer stem cells. Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).
  2. Arai, F., et al. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic ste....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved