تحديد الخلايا الهادئة في نموذج سرطان الدم الليمفاوي الحاد في الخلايا التائية الزرد باستخدام تلطيخ تكاثر الخلايا

Summary

استخدمنا تلطيخ تكاثر الخلايا لتحديد الخلايا الهادئة في نموذج سرطان الدم الليمفاوي الحاد T-zebrafish. يتم الاحتفاظ بالبقعة في الخلايا غير المنقسمة وتقليلها أثناء تكاثر الخلايا ، مما يتيح اختيار الخلايا الخاملة لمزيد من الاستجواب. يوفر هذا البروتوكول أداة وظيفية لدراسة التجديد الذاتي في سياق السكون الخلوي.

Abstract

السكون الخلوي هو حالة توقف النمو أو تباطؤ الانتشار الموصوف في الخلايا الجذعية الطبيعية والسرطانية (CSCs). قد يحمي الهدوء الخلايا الجذعية السرطانية من أدوية العلاج الكيميائي المضادة للتكاثر. في نماذج الفئران المصابة بابيضاض الدم الليمفاوي الحاد للخلايا التائية (T-ALL) المشتقة من المريض (PDX) ، ترتبط الخلايا الهادئة بمقاومة العلاج والجذع. أصباغ تكاثر الخلايا هي أدوات شائعة لتتبع انقسام الخلايا. ترتكز صبغة الفلورسنت تساهميا في مجموعات الأمين على الغشاء والجزيئات الكبيرة داخل الخلية. يسمح هذا بتتبع الخلايا المصنفة لما يصل إلى 10 أقسام ، والتي يمكن حلها عن طريق قياس التدفق الخلوي.

في النهاية ، سيكون للخلايا ذات أعلى معدلات الانتشار احتفاظ منخفض بالصبغة ، حيث سيتم تخفيفها مع كل انقسام خلوي ، في حين أن الخلايا الخاملة ذات الانقسام البطيء سيكون لها أعلى احتفاظ. تم تحسين استخدام أصباغ تكاثر الخلايا لعزل الخلايا الخاملة ووصفها في نماذج الماوس T-ALL. استكمالا لنماذج الفئران الحالية ، يوفر نموذج T-ALL المشتق من rag2: Myc مكانا ممتازا لاستجواب التجديد الذاتي في T-ALL بسبب التردد العالي للخلايا الجذعية اللوكيمية (LSCs) وراحة الزرد لتجارب الزرع واسعة النطاق.

هنا ، نصف سير العمل لتلطيخ خلايا الزرد T-ALL بصبغة تكاثر الخلايا ، وتحسين تركيز الصبغة لخلايا الزرد ، وتمرير الخلايا الملطخة بنجاح في الجسم الحي ، وجمع الخلايا بمستويات متفاوتة من الاحتفاظ بالصبغة عن طريق فرز الخلايا الحية من المزروعة. نظرا لعدم وجود صانعي أسطح خلايا راسخين ل LSCs في T-ALL ، يوفر هذا النهج وسيلة وظيفية لاستجواب الخلايا الهادئة في الجسم الحي. للحصول على نتائج تمثيلية ، نصف كفاءة النقش وتردد LSC للخلايا ذات الاحتفاظ بالصبغة العالية والمنخفضة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التحقق من الخصائص الإضافية للخلايا الهادئة ، بما في ذلك الاستجابة للأدوية ، وملفات تعريف النسخ ، والتشكل.

Introduction

الخلايا الجذعية البالغة هي المسؤولة عن تجديد أنواع الخلايا المتمايزة في عضو معين وهي موجودة في الغالب في حالة نائمة وغير مقسمة ^1,2. على سبيل المثال ، تظل الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) ، التي تحافظ على الدم ، هادئة إلى حد كبير ، ولا يدخل سوى جزء صغير دورة الخلية للتجديد الذاتي أو التمايز لتوليد مكونات دم ناضجة³. وبالمثل ، في السرطانات ، تمتلك مجموعة فرعية نادرة من الخلايا تسمى الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs) القدرة على التجديد الذاتي وهي مسؤولة عن الحفاظ على الورم الخبيث على المدى الطويل⁴. توجد الخلايا الجذعية السرطانية

Protocol

في هذا البروتوكول ، نستخدم خلايا T-ALL التي تحمل علامة GFP والتي تم إنشاؤها مسبقا في سلالة CG1 وبالتالي يمكن حقنها مباشرة في الزرد CG1 المتلقي¹⁵. باختصار ، تم إنشاء سرطان الدم عن طريق الحقن المجهري للحمض النووي من rag2: Myc و rag2: GFP في أجنة الزرد CG1 أحادية الخلية. تمت مراقبة لتطور سرطان الدم بدءا من 3 أسابيع بعد الحقن ، باستخدام الفحص المجهري الفلوري. تم عزل خلايا ابيضاض الدم الإيجابية ل GFP FACS وزرعها بشكل متسلسل في سمك الزرد CG1 المتلقي لتوليد استنساخ بتردد عال من LSC. تم وصف تفاصيل البروتوكول بأكمله بواسطة Blackburn et ^al.15.

بدلا من ....

النتائج

لقد اتبعنا البروتوكول الموصوف أعلاه لفرز الخلايا التي احتفظت بصبغة تكاثر الخلايا ، CT-FR ، واستخدمناها لمقايسة التخفيف المحدد (LDA) لتقدير تردد LSC في مجموعات CT-FR العالية و CT-FR المنخفضة. لضبط البوابة لتجربة قياس التدفق الخلوي ، استخدمنا عنصر تحكم بدون فلوروفور (بدون لون) بالإض.......

Discussion

من المعروف أن LSCs مقاومة للعلاجات الكيميائية التقليدية المضادة للتكاثر ، وإيجاد علاجات مستهدفة ضد هذه الخلايا يحمل وعدا كبيرا في الحد من حدوث الانتكاس وتحسين تشخيص المريض²⁰. وصفت الأبحاث السابقة استخدام بقع تكاثر الخلايا الفلورية لتحديد مجموعة صغيرة من الخ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA