Идентификация покоящихся клеток в модели острого лимфобластного лейкоза Т-клеток данио-рерио с использованием окрашивания пролиферацией клеток

Резюме

Мы использовали окрашивание пролиферацией клеток для идентификации спокойных клеток в модели Т-острого лимфобластного лейкоза рыбок данио. Окрашивание сохраняется в неделящихся клетках и уменьшается во время пролиферации клеток, что позволяет отобрать спящие клетки для дальнейшего исследования. Этот протокол предоставляет функциональный инструмент для изучения самообновления в контексте клеточного покоя.

Аннотация

Клеточный покой — это состояние остановки роста или замедления пролиферации, которое описывается в нормальных и раковых стволовых клетках (ОСК). Состояние покоя может защитить ЦСК от антипролиферативных химиотерапевтических препаратов. В мышиных моделях ксенотрансплантата (PDX) с Т-клеточным острым лимфобластным лейкозом (Т-ОЛЛ) покоящиеся клетки связаны с резистентностью к лечению и стволовостью. Красители для пролиферации клеток являются популярными инструментами для отслеживания деления клеток. Флуоресцентный краситель ковалентно закреплен в аминогруппах на мембране и макромолекулах внутри клетки. Это позволяет отслеживать меченые клетки до 10 делений, которые могут быть разрешены с помощью проточной цитометрии.

В конечном счете, клетки с самыми высокими темпами пролиферации будут иметь низкое удержание красителя, так как он будет разбавляться при каждом делении клетки, в то время как спящие, медленно делящиеся клетки будут иметь наибольшее удержание. Использование красителей для пролиферации клеток для выделения спящих клеток было оптимизировано и описано в мышиных моделях T-ALL. В дополнение к существующим моделям мышей, модель T-ALL рыбок данио-рерио rag2:Myc обеспечивает прекрасную площадку для изучения самообновления в T-ALL благодаря высокой частоте лейкемических стволовых клеток (LSC) и удобству рыбок данио для крупномасштабных экспериментов по трансплантации.

В этой статье мы описываем рабочий процесс окрашивания клеток T-ALL рыбок данио с помощью красителя для пролиферации клеток, оптимизацию концентрации красителя для клеток рыбок данио, пассирование успешно окрашенных клеток in vivo и сбор клеток с различными уровнями удержания красителя путем сортировки живых клеток от трансплантированных животных. Учитывая отсутствие хорошо зарекомендовавших себя создателей клеточной поверхности для LSC в T-ОЛЛ, этот подход предоставляет функциональные средства для опроса неактивных клеток in vivo. Для получения репрезентативных результатов мы описываем эффективность приживления и частоту LSC для клеток с высоким и низким уровнем удержания красителя. Этот метод может помочь исследовать дополнительные свойства спокойных клеток, включая реакцию на лекарственные препараты, профили транскрипции и морфологию.

Введение

Взрослые стволовые клетки отвечают за регенерацию дифференцированных типов клеток в данном органе и преимущественно присутствуют в спящем, неделящемся состоянии ^1,2. Например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК), которые поддерживают кровь, в основном остаются в покое, и только небольшая часть вступает в клеточный цикл для самообновления или дифференцировки с образованием зрелых^{компонентов крови}. Аналогичным образом, при раке редкая субпопуляция клеток, называемая раковыми стволовыми клетками (ОСК), обладает способностью к самообновлению и отвечает з....

протокол

В этом протоколе мы используем меченые GFP клетки T-ALL данио-рерио, которые были ранее получены в штамме CG1 и, таким образом, могут быть непосредственно введены в реципиентную сингенную CG1^{данио-рерио 15}. Вкратце, лейкемия была получена путем микроинъекции ДНК rag2:Myc и rag2:GFP в одноклеточные эмбрионы CG1 данио-рерио. За животными наблюдали на предмет развития лейкоза, начиная с 3 недель после инъекции, с помощью флуоресцентной микроскопии. GFP-положительные лейкозные клетки были выделены FACS и серийно трансплантированы реципиентным CG1 данио-рерио для получения клонов с высокой частотой....

Результаты

Мы следовали описанному выше протоколу для сортировки клеток, которые сохранили краситель для пролиферации клеток, CT-FR, и использовали их для анализа предельного разведения (LDA) для оценки частоты LSC в популяциях CT-FR High и CT-FR Low. Чтобы установить стробирование для экспер.......

Обсуждение

Известно, что ЛСК устойчивы к традиционным, антипролиферативным химиотерапевтическим методам, и поиск таргетной терапии против этих клеток имеет большие перспективы в снижении частоты рецидивов и улучшении прогноза для^{пациентов.} В предыдущем исследов?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA