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Utilizamos la tinción de proliferación celular para identificar células quiescentes en el modelo de leucemia linfoblástica aguda T de pez cebra. La tinción se retiene en las células que no se dividen y se reduce durante la proliferación celular, lo que permite la selección de células inactivas para su posterior interrogación. Este protocolo proporciona una herramienta funcional para estudiar la autorrenovación en el contexto de la quiescencia celular.
La quiescencia celular es un estado de detención del crecimiento o proliferación lenta que se describe en las células madre normales y cancerosas (CSC). La quiescencia puede proteger a las CSC de los fármacos quimioterapéuticos antiproliferativos. En los modelos de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T), las células quiescentes se relacionan con la resistencia al tratamiento y la madre. Los tintes para la proliferación celular son herramientas populares para el seguimiento de la división celular. El colorante fluorescente se ancla covalentemente en grupos amina en la membrana y macromoléculas dentro de la célula. Esto permite el seguimiento de las células marcadas hasta 10 divisiones, que pueden resolverse mediante citometría de flujo.
En última instancia, las células con las tasas de proliferación más altas tendrán una baja retención de colorante, ya que se diluirá con cada división celular, mientras que las células inactivas y de división más lenta tendrán la mayor retención. El uso de colorantes de proliferación celular para aislar células inactivas se ha optimizado y descrito en modelos de ratón con LLA-T. Complementario a los modelos de ratón existentes, el modelo de LLA-ALL de pez cebra derivado de rag2:Myc proporciona un excelente lugar para interrogar la autorrenovación en la LLA-T debido a la alta frecuencia de células madre leucémicas (LSC) y la conveniencia del pez cebra para experimentos de trasplante a gran escala.
Aquí, describimos el flujo de trabajo para la tinción de células T-ALL de pez cebra con un colorante de proliferación celular, optimizando la concentración del colorante para células de pez cebra, pasando células teñidas con éxito in vivo y la recolección de células con diferentes niveles de retención de colorante mediante la clasificación de células vivas de animales trasplantados. Dada la ausencia de creadores de superficie celular bien establecidos para las LSC en la LLA-T, este enfoque proporciona un medio funcional para interrogar a las células inactivas in vivo. Para obtener resultados representativos, describimos la eficiencia del injerto y la frecuencia de LSC de celdas de alta y baja retención de colorante. Este método puede ayudar a investigar propiedades adicionales de las células quiescentes, incluida la respuesta a los fármacos, los perfiles transcripcionales y la morfología.
Las células madre adultas son responsables de la regeneración de tipos celulares diferenciados en un órgano determinado y están presentes predominantemente en un estado latente y no dividido 1,2. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC), que mantienen la sangre, permanecen en gran medida inactivas, y solo una pequeña fracción ingresa al ciclo celular para autorenovarse o diferenciarse paragenerar componentes sanguíneos maduros. De manera similar, en los cánceres, una subpoblación rara de células llamadas células madre cancerosas (CSC) poseen la capacidad de autorrenovación y son responsables del mantenimiento a largo plazo de la neoplasiamaligna. Las células madre cancerosas existen in vivo en un estado de quietud o crecimiento lento, lo que puede permitirles escapar de los tratamientos antiproliferativos contra el cáncer5, evadir la eliminación del sistema inmunológico6, reducir el estrés oxidativo y mejorar sus vías de reparación del ADN7. Incluso un número bajo de CSC que quedan después del tratamiento puede potencialmente repoblar el tumor, lo que resulta en la recaída del paciente8. En consecuencia, la comprensión de la quiescencia celular es muy prometedora para la identificación de posibles vulnerabilidades de las CSC y el desarrollo de nuevas formas de abordarlas.
Los colorantes de proliferación celular, como la tinción de éster de carboxifluoresceína succinimidilo (CFSE) y sus derivados, se utilizan comúnmente para rastrear la frecuencia de las divisiones celulares9. El colorante penetra a través de la membrana celular y, una vez dentro de la célula, se activa mediante esterasas intracelulares en un producto fluorescente. El compuesto fluorescente resultante se retiene dentro de la célula a través de los enlaces amida covalentes formados entre la fracción succinimidil y los grupos funcionales amina de las proteínas intracelulares10. Con cada división celular, el compuesto fluorescente se divide en partes iguales entre las dos células resultantes, lo que provoca una dilución de señal doble. Este colorante permite la detección de hasta 10 divisiones celulares mediante análisis de citometría de flujo11.
Este enfoque se ha utilizado previamente para enriquecer las poblaciones de CSC in vitro mediante la identificación de poblaciones de células de ciclo lento con alta retención del colorante11,12. En la LLA-T, la CFSE se ha utilizado para rastrear el crecimiento tumoral in vivo en xenoinjertos derivados de pacientes en ratones. Después del marcaje celular y tres semanas de trasplante, el análisis de citometría de flujo mostró una población rara de células que aún conservaban la fluorescencia de CFSE. Esta población se asoció con la madre, la resistencia al tratamiento y la alta similitud con las células causantes de recaídas en los pacientes13. En consecuencia, este colorante proporciona una herramienta útil para el estudio de los fenotipos de células madre de leucemia (LSC) en la LLA-T.
El objetivo del trabajo es extender la aplicación del colorante de proliferación celular para estudiar la quiescencia in vivo utilizando un modelo de LLA-T de pez cebra. En particular, el modelo14 de pez cebra T-ALL impulsado por rag2:Myc proporciona un excelente lugar para el estudio de la autorrenovación debido a la alta frecuencia de LSC en comparación con los modelos de ratón y las enfermedades humanas15. Además, el uso del pez cebra permite realizar estudios de trasplante a gran escala, que pueden realizarse a un costo mucho menor de cuidado y mantenimiento en comparación con sus contrapartes de ratón16. El pez cebra también es excelente para aplicaciones de imágenes en vivo, ya que las células tumorales marcadas con fluorescencia se pueden ver fácilmente utilizando un microscopio de fluorescencia simple para estimar la tasa de desarrollotumoral.
En este protocolo, describimos el flujo de trabajo para la tinción de células T-ALL de pez cebra con colorante de proliferación celular seguido de la propagación in vivo de células teñidas en pez cebra singénico CG1. Tras el desarrollo de la leucemia, describimos la clasificación de las células que retuvieron el colorante y su uso para un posterior experimento de trasplante de dilución limitante para cuantificar las tasas de autorrenovación de LSC. Este protocolo puede ampliarse para aplicaciones adicionales, incluido el cribado in vivo de fármacos de posibles compuestos para dirigirse a las LSC inactivas. Además, las células recolectadas se pueden utilizar para diferentes análisis posteriores, como el perfil transcriptómico, la proteómica y la metabolómica, lo que ofrece información única sobre el comportamiento de las LSC inactivas en la LLA-T.
En este protocolo, estamos utilizando células T-ALL de pez cebra marcadas con GFP que se generaron previamente en la cepa CG1 y, por lo tanto, pueden inyectarse directamente en el pez cebra CG1 singénicoreceptor 15. En resumen, la leucemia se generó por microinyección de ADN de rag2:Myc y rag2:GFP en embriones unicelulares de pez cebra CG1. Los animales fueron monitoreados para el desarrollo de leucemia a partir de las 3 semanas posteriores a la inyección, utilizando microscopía de fluorescencia. Las células leucémicas positivas para GFP se aislaron en FACS y se trasplantaron en serie en el pez cebra receptor CG1 para generar clones con una alta frecuencia de LSC. Los detalles de todo el protocolo son descritos por Blackburn et al.15.
Alternativamente, la T-ALL derivada de rag2:Myc primaria puede generarse mediante microinyección de ADN de embriones de pez cebra17. La microinyección de ADN de rag2:Myc con un reportero fluorescente impulsado por rag2, como GFP, puede dar lugar al desarrollo de células B, células T y ALL18 mixtas. Se verificó previamente que los clones de leucemia utilizados en este protocolo eran T-ALL15. Todos los procedimientos experimentales con pez cebra fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky, protocolo 2019-3399.
1. Propagación de células de LLA-T de pez cebra in vivo
2. Recolección de células leucémicas marcadas con fluorescencia
3. Optimización de la concentración del colorante de proliferación celular (CellTrace Far Red) para la tinción y la viabilidad celular del pez cebra
NOTA: Para este protocolo, y dado que las células tumorales están marcadas con GFP, utilizamos un colorante de proliferación de glóbulos rojos lejanos (CellTrace Far Red) para evitar la superposición espectral, que se denominará CT-FR.
4. Propagación de células de pez cebra T-ALL teñidas con CT-FR in vivo
5. Preparación para la clasificación de células T-ALL de pez cebra teñidas con CT-FR
6. Clasificación
NOTA: Mantenga todos los tubos y la placa donante en hielo todo el tiempo, excepto cuando se use para clasificar.
7. Trasplante de células clasificadas en la dilución límite y seguimiento de la aparición del tumor
8. Determinación de la frecuencia de células madre leucémicas
Figura 1: Flujo de trabajo para el uso de la tinción de seguimiento celular para aislar células inactivas en el modelo T-ALL de pez cebra. Ilustración esquemática de la tinción de células T-ALL de pez cebra con la tinción de proliferación celular, la propagación en un pez cebra CG1 (panel superior) y la clasificación de las células en función de la retención de la tinción de proliferación celular (panel central). Las células recolectadas se utilizaron para un ensayo de dilución limitante para determinar la frecuencia de LSC (panel inferior). Abreviaturas: LLA-T = leucemia linfoblástica aguda de células T; LSC = células madre leucémicas; CT-FR = CellTrace rojo lejano; FITC = isotiocianato de fluoresceína; PE = ficoeritrina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Seguimos el protocolo descrito anteriormente para clasificar las células que han retenido el colorante de proliferación celular, CT-FR, y las utilizamos para un ensayo de dilución limitante (LDA) para estimar la frecuencia de LSC en las poblaciones de CT-FR High y CT-FR Low. Para establecer la compuerta para el experimento de citometría de flujo, utilizamos un control sin fluoróforo (sin color) además de controles de un solo color (Figura 2A).<...
Se sabe que las LSC son resistentes a los tratamientos convencionales de quimioterapia antiproliferativa, y el hallazgo de terapias dirigidas contra estas células es muy prometedor para reducir la aparición de recaídas y mejorar el pronóstico de los pacientes20. Investigaciones previas describieron el uso de tinciones de proliferación celular fluorescente para identificar una pequeña población de células quiescentes asociadas con resistencia a medicamentos...
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
La financiación de esta investigación fue proporcionada por el Instituto Nacional del Cáncer (R37CA227656 a JSB). Esta investigación también fue apoyada por los Recursos Compartidos de Citometría de Flujo y Monitoreo Inmunológico del Centro Oncológico Markey de la Universidad de Kentucky (P30CA177558).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
26 G/2” micro-syringe | Hamilton | 87930 | NA |
35 µm filter cap FACS tubes | Falcon | 352235 | NA |
40 µm cell strainer | CELLTREAT | 229482 | NA |
96-well skirted PCR plate | Thermo Fisher Scientific | AB0800 | NA |
Cell sorter | Sony Biotechnology | SY3200 | NA |
CellTrace Far Red | Thermo Fisher Scientific | C34564 | NA |
Conical tubes | VWR | 10026-078 | NA |
DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62248 | NA |
DMSO | Sigma-Aldrich | D4818 | NA |
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS) | Caisson Labs | 22110001 | NA |
Epifluorescence stereo microscope | Nikon | SMZ25 | NA |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | 12306C | NA |
Fish system water | N/A | N/A | 0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific | C2171 | NA |
MS-222 | Pentaire | TRS-1 | tricaine mesylate, an anesthetic |
Petri dishes | Corning | 07-202-011 | NA |
Razor blades | American Line | 66-0089 | NA |
Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | NA |
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