Identificación de células quiescentes en un modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de pez cebra mediante tinción de proliferación celular

Resumen

Utilizamos la tinción de proliferación celular para identificar células quiescentes en el modelo de leucemia linfoblástica aguda T de pez cebra. La tinción se retiene en las células que no se dividen y se reduce durante la proliferación celular, lo que permite la selección de células inactivas para su posterior interrogación. Este protocolo proporciona una herramienta funcional para estudiar la autorrenovación en el contexto de la quiescencia celular.

Resumen

La quiescencia celular es un estado de detención del crecimiento o proliferación lenta que se describe en las células madre normales y cancerosas (CSC). La quiescencia puede proteger a las CSC de los fármacos quimioterapéuticos antiproliferativos. En los modelos de ratón de xenoinjerto derivado de pacientes (PDX) de leucemia linfoblástica aguda de células T (LLA-T), las células quiescentes se relacionan con la resistencia al tratamiento y la madre. Los tintes para la proliferación celular son herramientas populares para el seguimiento de la división celular. El colorante fluorescente se ancla covalentemente en grupos amina en la membrana y macromoléculas dentro de la célula. Esto permite el seguimiento de las células marcadas hasta 10 divisiones, que pueden resolverse mediante citometría de flujo.

En última instancia, las células con las tasas de proliferación más altas tendrán una baja retención de colorante, ya que se diluirá con cada división celular, mientras que las células inactivas y de división más lenta tendrán la mayor retención. El uso de colorantes de proliferación celular para aislar células inactivas se ha optimizado y descrito en modelos de ratón con LLA-T. Complementario a los modelos de ratón existentes, el modelo de LLA-ALL de pez cebra derivado de rag2:Myc proporciona un excelente lugar para interrogar la autorrenovación en la LLA-T debido a la alta frecuencia de células madre leucémicas (LSC) y la conveniencia del pez cebra para experimentos de trasplante a gran escala.

Aquí, describimos el flujo de trabajo para la tinción de células T-ALL de pez cebra con un colorante de proliferación celular, optimizando la concentración del colorante para células de pez cebra, pasando células teñidas con éxito in vivo y la recolección de células con diferentes niveles de retención de colorante mediante la clasificación de células vivas de animales trasplantados. Dada la ausencia de creadores de superficie celular bien establecidos para las LSC en la LLA-T, este enfoque proporciona un medio funcional para interrogar a las células inactivas in vivo. Para obtener resultados representativos, describimos la eficiencia del injerto y la frecuencia de LSC de celdas de alta y baja retención de colorante. Este método puede ayudar a investigar propiedades adicionales de las células quiescentes, incluida la respuesta a los fármacos, los perfiles transcripcionales y la morfología.

Introducción

Las células madre adultas son responsables de la regeneración de tipos celulares diferenciados en un órgano determinado y están presentes predominantemente en un estado latente y no dividido ^1,2. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC), que mantienen la sangre, permanecen en gran medida inactivas, y solo una pequeña fracción ingresa al ciclo celular para autorenovarse o diferenciarse para^{generar componentes} sanguíneos maduros. De manera similar, en los cánceres, una subpoblación rara de células llamadas células madre cancerosas (CSC) poseen....

Protocolo

En este protocolo, estamos utilizando células T-ALL de pez cebra marcadas con GFP que se generaron previamente en la cepa CG1 y, por lo tanto, pueden inyectarse directamente en el pez cebra CG1 singénico^{receptor 15}. En resumen, la leucemia se generó por microinyección de ADN de rag2:Myc y rag2:GFP en embriones unicelulares de pez cebra CG1. Los animales fueron monitoreados para el desarrollo de leucemia a partir de las 3 semanas posteriores a la inyección, utilizando microscopía de fluorescencia. Las células leucémicas positivas para GFP se aislaron en FACS y se trasplantaron en serie en el pe....

Discusión

Se sabe que las LSC son resistentes a los tratamientos convencionales de quimioterapia antiproliferativa, y el hallazgo de terapias dirigidas contra estas células es muy prometedor para reducir la aparición de recaídas y mejorar el pronóstico de los pacientes²⁰. Investigaciones previas describieron el uso de tinciones de proliferación celular fluorescente para identificar una pequeña población de células quiescentes asociadas con resistencia a medicamentos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA