세포 증식 염색을 사용한 제브라피시 T 세포 급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포 식별

요약

우리는 세포 증식 염색을 사용하여 제브라피시 T-급성 림프모구성 백혈병 모델에서 정지 세포를 식별했습니다. 염색은 분열하지 않는 세포에 유지되고 세포 증식 중에 감소하여 추가 조사를 위해 휴면 세포를 선택할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포 정지의 맥락에서 자가 재생을 연구하기 위한 기능적 도구를 제공합니다.

초록

세포 정지는 정상 및 암 줄기 세포(CSC)에 설명된 성장 정지 또는 느린 증식 상태입니다. Quiescence는 항증식성 화학 요법 약물로부터 CSC를 보호할 수 있습니다. T세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL) 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델에서 정지 세포는 치료 저항성 및 줄기 농도와 관련이 있습니다. 세포 증식 염료는 세포 분열을 추적하는 데 널리 사용되는 도구입니다. 형광 염료는 세포막의 아민기와 세포 내부의 거대분자에 공유 결합되어 있습니다. 이를 통해 최대 10개의 분열에 대해 라벨링된 세포를 추적할 수 있으며, 이는 유세포 분석으로 해결할 수 있습니다.

궁극적으로 증식 속도가 가장 높은 세포는 세포 분열할 때마다 희석되기 때문에 염료 유지율이 낮고, 휴면 상태이며 분열 속도가 느린 세포는 가장 높은 유지력을 갖습니다. 휴면 세포를 분리하기 위한 세포 증식 염료의 사용은 T-ALL 마우스 모델에서 최적화되고 설명되었습니다. 기존 마우스 모델을 보완하는 rag2:Myc 유래 제브라피시 T-ALL 모델은 백혈병 줄기세포(LSC)의 빈도가 높고 대규모 이식 실험을 위한 제브라피시의 편리성으로 인해 T-ALL에서 자가 재생을 조사할 수 있는 훌륭한 장소를 제공합니다.

여기에서는 세포 증식 염료를 사용한 제브라피시 T-ALL 세포 염색, 제브라피시 세포의 염료 농도 최적화, 성공적으로 염색된 생체 내 세포 패시에이지, 이식된 동물에서 살아있는 세포 분류를 통해 다양한 염료 머무름 수준을 가진 세포 수집을 위한 워크플로우에 대해 설명합니다. T-ALL에 LSC에 대한 잘 정립된 세포 표면 메이커가 없다는 점을 감안할 때, 이 접근 방식은 생체 내에서 정지 세포를 조사할 수 있는 기능적 수단을 제공합니다. 대표적인 결과를 위해, 우리는 생착 효율과 고농도 및 저염료 보유 세포의 LSC 빈도를 설명합니다. 이 방법은 약물 반응, 전사 프로필 및 형태를 포함한 정지 세포의 추가 특성을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서문

성체 줄기세포는 주어진 장기에서 분화된 세포 유형의 재생을 담당하며, 주로 휴면 상태, 분열하지 않는 상태로 존재한다 ^1,2. 예를 들어, 혈액을 유지하는 조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 대부분 정지 상태를 유지하며, 극히 일부만이 세포주기에 들어가 자가 재생하거나 분화하여 성숙한 혈액 성분을 생성한다³. 이와 유사하게, 암의 경우, 암 줄기세포(cancer stem cell, CSCs)라고 불리는 희귀한 세포의 하위 집단(subpopulation)이 자가 재생 능력을 가지고 있으며, 악성 종양의 장기 유지를 담당한다⁴. 암 줄기세포는 생체 내에서 정지 상태 또는 느린 성장 상태로 존재하며, 이로 인해 항증식성 암 치료5를^{회피하고, 면역 체계의} 제거를 회피하고6, 산화 스트레스를 줄이고, DNA 복구 경로를 향상시킬 수^있다7. 치료 후 남겨진 CSC의 수가 적어도 종양....

프로토콜

이 프로토콜에서는 이전에 CG1 균주에서 생성된 GFP 표지 제브라피시 T-ALL 세포를 사용하여 수혜자 합성 CG1 제브라피시¹⁵에 직접 주입할 수 있습니다. 간단히 말해서, 백혈병은 단세포 CG1 제브라피시 배아에 rag2:Myc 및 rag2:GFP 의 DNA 미세 주입에 의해 생성되었습니다. 동물은 형광 현미경을 사용하여 주사 후 3주부터 백혈병 발병을 모니터링했습니다. GFP 양성 백혈병 세포를 FACS로 분리하고 수혜자 CG1 제브라피시에 연속적으로 이식하여 고빈도의 LSC를 가진 클론을 생성했습니다. 전체 프로토콜에 대한 자세한 내용은 Blackburn et ^al.15에 설명되어 있습니다.

대안적으로, 1차 rag2:Myc-유래 T-ALL은 제브라피시 배아¹⁷의 DNA 미세주입에 의해 생성될 수 있다. GFP와 같은 rag2 기반 형광 리포터를 사용하여 rag2:Myc 의 DNA 미세 주입은 B 세포, T 세포 및 혼합 ALL¹⁸의 발달을 ....

토론

LSC는 기존의 항증식 화학요법 치료에 내성이 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 세포에 대한 표적 치료법을 찾는 것은 재발 발생을 줄이고 환자 예후를 개선하는 데 큰 가능성을 가지고 있습니다²⁰. 이전 연구에서는 T-ALL PDX 모델¹³에서 약물 내성 및 줄기성과 관련된 소량의 정지 세포 집단을 식별하기 위해 형광 세포 증식 염색을 사용?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA