Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire

Résumé

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Résumé

La quiescence cellulaire est un état d’arrêt de la croissance ou de prolifération ralentie qui est décrit dans les cellules souches normales et cancéreuses (CSC). La quiescence peut protéger les CSC contre les agents chimiothérapeutiques antiprolifératifs. Dans les modèles murins de xénogreffe dérivée de patients (PDX) de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T (T-LLA), les cellules quiescentes sont associées à la résistance au traitement et à la souche. Les colorants de prolifération cellulaire sont des outils populaires pour le suivi de la division cellulaire. Le colorant fluorescent est ancré de manière covalente dans des groupes d’amines sur la membrane et des macromolécules à l’intérieur de la cellule. Cela permet de suivre les cellules marquées jusqu’à 10 divisions, qui peuvent être résolues par cytométrie en flux.

En fin de compte, les cellules ayant les taux de prolifération les plus élevés auront une faible rétention de colorant, car il sera dilué à chaque division cellulaire, tandis que les cellules dormantes à division plus lente auront la rétention la plus élevée. L’utilisation de colorants de prolifération cellulaire pour isoler les cellules dormantes a été optimisée et décrite dans des modèles murins T-LAL. En complément des modèles murins existants, le modèle T-ALL dérivé du poisson-zèbre rag2 :Myc offre un excellent moyen d’interroger l’auto-renouvellement dans la T-ALL en raison de la fréquence élevée des cellules souches leucémiques (LSC) et de la commodité du poisson-zèbre pour les expériences de transplantation à grande échelle.

Ici, nous décrivons le flux de travail pour la coloration des cellules T-ALL du poisson-zèbre avec un colorant de prolifération cellulaire, l’optimisation de la concentration du colorant pour les cellules de poisson-zèbre, le passage des cellules colorées avec succès in vivo et la collecte de cellules avec différents niveaux de rétention de colorant par tri de cellules vivantes d’animaux transplantés. Étant donné l’absence de fabricants de surface cellulaire bien établis pour les LSC dans la T-ALL, cette approche fournit un moyen fonctionnel d’interroger les cellules quiescentes in vivo. Pour des résultats représentatifs, nous décrivons l’efficacité de la greffe et la fréquence LSC des cellules à haute et basse rétention de colorant. Cette méthode peut aider à étudier d’autres propriétés des cellules quiescentes, notamment la réponse aux médicaments, les profils transcriptionnels et la morphologie.

Introduction

Les cellules souches adultes sont responsables de la régénération des types de cellules différenciées dans un organe donné et sont principalement présentes dans^{un état} dormant et non divisé1,2. Par exemple, les cellules souches hématopoïétiques (CSH), qui maintiennent le sang, restent en grande partie quiescentes, et seule une petite fraction entre dans le cycle cellulaire pour s’auto-renouveler ou se différencier afin de générer des composants sanguins matures³. De même, dans les cancers, une sous-population rare de cellules appelées cellules souches c....

Protocole

Dans ce protocole, nous utilisons des cellules T-ALL de poisson-zèbre marquées à la GFP qui ont été générées précédemment dans la souche CG1 et peuvent donc être directement injectées dans le poisson-zèbre syngénique CG1¹⁵ du receveur. En bref, la leucémie a été générée par micro-injection d’ADN de rag2 :Myc et rag2 :GFP dans des embryons de poisson-zèbre CG1 unicellulaires. Les animaux ont été surveillés pour le développement d’une leucémie à partir de 3 semaines après l’injection, à l’aide de la microscopie à fluorescence. Des cellules leucémiques positives à la GFP ont été isolées par FACS ....

Discussion

Les CSL sont connues pour être résistantes aux traitements de chimiothérapie anti-prolifératifs conventionnels, et la découverte de thérapies ciblées contre ces cellules est très prometteuse pour réduire l’occurrence des rechutes et améliorer le pronostic des patients²⁰. Des recherches antérieures ont décrit l’utilisation de colorants fluorescents de prolifération cellulaire pour identifier une petite population de cellules quiescentes associées .......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA