Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması

Özet

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Özet

Hücresel sessizlik, normal ve kanser kök hücrelerinde (CSC'ler) tanımlanan bir büyüme durması veya yavaş proliferasyon durumudur. Sessizlik, CSC'leri antiproliferatif kemoterapi ilaçlarından koruyabilir. T hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) fare modellerinde, hareketsiz hücreler tedavi direnci ve saplılık ile ilişkilidir. Hücre proliferasyon boyaları, hücre bölünmesinin izlenmesi için popüler araçlardır. Floresan boya, hücre içindeki zar ve makromoleküller üzerindeki amin gruplarına kovalent olarak sabitlenir. Bu, etiketli hücrelerin akış sitometrisi ile çözülebilen 10 bölünmeye kadar izlenmesine izin verir.

Sonuç olarak, en yüksek proliferasyon oranlarına sahip hücreler, her hücre bölünmesiyle seyreltileceği için düşük boya tutma özelliğine sahip olurken, uykuda, daha yavaş bölünen hücreler en yüksek tutma özelliğine sahip olacaktır. Uyuyan hücreleri izole etmek için hücre proliferasyon boyalarının kullanımı optimize edilmiş ve T-ALL fare modellerinde tanımlanmıştır. Mevcut fare modellerini tamamlayıcı olarak rag2:Myc'den türetilen zebra balığı T-ALL modeli, lösemik kök hücrelerin (LSC'ler) yüksek sıklığı ve zebra balığının büyük ölçekli nakil deneyleri için rahatlığı nedeniyle T-ALL'de kendini yenilemeyi sorgulamak için mükemmel bir mekan sağlar.

Burada, zebra balığı T-ALL hücrelerinin bir hücre proliferasyon boyası ile boyanması, zebra balığı hücreleri için boya konsantrasyonunun optimize edilmesi, başarılı şekilde boyanmış hücrelerin in vivo olarak geçirilmesi ve nakledilen hayvanlardan canlı hücre sınıflandırması ile değişen seviyelerde boya tutma özelliklerine sahip hücrelerin toplanması için iş akışını açıklıyoruz. T-ALL'de LSC'ler için iyi kurulmuş hücre yüzeyi yapıcılarının yokluğu göz önüne alındığında, bu yaklaşım hareketsiz hücreleri in vivo olarak sorgulamak için işlevsel bir araç sağlar. Temsili sonuçlar için, yüksek ve düşük boya tutucu hücrelerin aşılama verimliliğini ve LSC frekansını açıklıyoruz. Bu yöntem, ilaç tepkisi, transkripsiyonel profiller ve morfoloji dahil olmak üzere hareketsiz hücrelerin ek özelliklerinin araştırılmasına yardımcı olabilir.

Giriş

Yetişkin kök hücreler, belirli bir organda farklılaşmış hücre tiplerinin yenilenmesinden sorumludur ve ağırlıklı olarak uykuda, bölünmeyen bir durumda bulunur ^1,2. Örneğin, kanı koruyan hematopoetik kök hücreler (HSC'ler) büyük ölçüde hareketsiz kalır ve olgun kan bileşenleri oluşturmak için kendini yenilemek veya farklılaşmak için hücre döngüsüne sadece küçük bir kısım girer³. Benzer şekilde, kanserlerde, kanser kök hücreleri (CSC'ler) adı verilen nadir bir hücre alt popülasyonu, kendini yenileme yeteneğine sahiptir ve malignitenin uzun süreli bakımınd....

Protokol

Bu protokolde, daha önce CG1 suşunda üretilen ve bu nedenle doğrudan alıcı sinjeneik CG1 zebra balığına¹⁵ enjekte edilebilen GFP etiketli zebra balığı T-ALL hücrelerini kullanıyoruz. Kısaca lösemi, tek hücreli CG1 zebra balığı embriyolarına rag2:Myc ve rag2:GFP'nin DNA mikroenjeksiyonu ile oluşturulmuştur. Hayvanlar, floresan mikroskobu kullanılarak enjeksiyondan 3 hafta sonra başlayarak lösemi gelişimi açısından izlendi. GFP pozitif lösemi hücreleri FACS izole edildi ve yüksek LSC frekansına sahip klonlar oluşturmak için alıcı CG1 zebra balığına seri olarak nakledildi. Tüm protokolün detaylar....

Tartışmalar

LSC'lerin konvansiyonel, anti-proliferatif kemoterapi tedavilerine dirençli olduğu bilinmektedir ve bu hücrelere karşı hedefe yönelik tedavilerin bulunması, nüks oluşumunu azaltmada ve hasta prognozunu iyileştirmede büyük umut vaat etmektedir²⁰. Önceki araştırmalar, T-ALL PDX modellerinde¹³ ilaç direnci ve saplılık ile ilişkili küçük bir hareketsiz hücre popülasyonunu tanımlamak için floresan hücre proliferasyon l.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA