זיהוי תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי T של דג זברה באמצעות צביעת התפשטות תאים

Summary

השתמשנו בצביעת התפשטות תאים כדי לזהות תאים שקטים במודל לוקמיה לימפובלסטית חריפה מסוג T של דג הזברה. הכתם נשמר בתאים שאינם מתחלקים ומצטמצם במהלך התפשטות התאים, מה שמאפשר בחירה של תאים רדומים להמשך חקירה. פרוטוקול זה מספק כלי פונקציונלי לחקר התחדשות עצמית בהקשר של שקט תאי.

Abstract

שקט תאי הוא מצב של עצירת גדילה או התפשטות איטית המתואר בתאי גזע נורמליים וסרטניים (CSC). שקט עשוי להגן על CSCs מפני תרופות כימותרפיות נוגדות שגשוג. במודלים של עכברי מסוג T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) שמקורם בחולה xenograft (PDX), תאים שקטים קשורים לעמידות לטיפול ולגזע. צבעי התפשטות תאים הם כלים פופולריים למעקב אחר חלוקת התא. הצבע הפלואורסצנטי מעוגן באופן קוולנטי לקבוצות אמין על הממברנה ומקרומולקולות בתוך התא. זה מאפשר מעקב אחר תאים מסומנים עבור עד 10 חלוקות, אשר ניתן לפתור על ידי ציטומטריית זרימה.

בסופו של דבר, תאים עם שיעורי ההתרבות הגבוהים ביותר יהיו בעלי שימור צבע נמוך, מכיוון שהוא ידולל עם כל חלוקת תא, בעוד שתאים רדומים המתחלקים לאט יותר יהיו בעלי השימור הגבוה ביותר. השימוש בצבעי התרבות תאים כדי לבודד תאים רדומים עבר אופטימיזציה ותואר במודלים של עכברי T-ALL. מודל T-ALL של דג הזברה שמקורו ב-rag2:Myc, המשלים את דגמי העכברים הקיימים, מספק מקום מצוין לחקור התחדשות עצמית ב-T-ALL בשל התדירות הגבוהה של תאי גזע לוקמיים (LSCs) והנוחות של דגי זברה לניסויי השתלה בקנה מידה גדול.

במאמר זה אנו מתארים את תהליך העבודה לצביעה של תאי T-ALL של דגי זברה באמצעות צבע להתרבות תאים, אופטימיזציה של ריכוז הצבע עבור תאי דגי זברה, העברת תאים מוכתמים בהצלחה in vivo, ואיסוף תאים עם רמות שונות של שימור צבע על ידי מיון תאים חיים מבעלי חיים מושתלים. בהתחשב בהיעדרם של יצרני משטחי תאים מבוססים היטב עבור LSCs ב- T-ALL, גישה זו מספקת אמצעי פונקציונלי לחקור תאים שקטים in vivo. לקבלת תוצאות מייצגות, אנו מתארים את יעילות הקליטה ואת תדר LSC של תאים שומרי צבע גבוהים ונמוכים. שיטה זו יכולה לסייע בחקירת תכונות נוספות של תאים שקטים, כולל תגובה לתרופות, פרופילי שעתוק ומורפולוגיה.

Introduction

תאי גזע בוגרים אחראים להתחדשות של סוגי תאים ממוינים באיבר נתון והם נמצאים בעיקר במצב רדום, לא מתחלק ^1,2. לדוגמה, תאי גזע המטופויטיים (HSCs), אשר שומרים על הדם, נשארים במידה רבה שקטים, ורק חלק קטן נכנס למחזור התא כדי לחדש את עצמם או להתמיין כדי לייצר מרכיבי דם בוגרים³. באופן דומה, בסרטן, תת-אוכלוסייה נדירה של תאים הנקראת תאי גזע סרטניים (CSC) היא בעלת יכולת התחדשות עצמית ואחראית לתחזוקה ארוכת טווח של הממאירות⁴. תאי גזע סרטניים קיימים in vivo במצב של שקט או צמיחה איטית, מה שעשוי לאפשר להם להימלט מטיפולים אנטי-שגשוגיים

Protocol

בפרוטוקול זה, אנו משתמשים בתאי T-ALL של דגי זברה בעלי תווית GFP שנוצרו בעבר בזן CG1 ולכן ניתן להזריק ישירות לדגי זברה CG1 סינגניים¹⁵. בקצרה, לוקמיה נוצרה על ידי מיקרו-הזרקה של DNA של rag2:Myc ו- rag2:GFP לעוברים חד-תאיים של דגי זברה CG1. בעלי חיים נוטרו להתפתחות לוקמיה החל מ-3 שבועות לאחר ההזרקה, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תאי לוקמיה חיוביים ל-GFP בודדו ב-FACS והושתלו סדרתית בדגי זברה CG1 מושתלים כדי ליצור שיבוטים בתדירות גבוהה של LSC. פרטים על הפרוטוקול כולו מתוארים על ידי Blackburn et ^al.15.

לחלופין, T-ALL ראשוני שמקורו ב-Rag2:Myc

תוצאות

עקבנו אחר הפרוטוקול המתואר לעיל כדי למיין תאים ששמרו על צבע התפשטות התא, CT-FR, והשתמשנו בהם לבדיקת דילול מגביל (LDA) כדי להעריך את תדירות LSC באוכלוסיות CT-FR High ו- CT-FR Low. כדי להגדיר את הגאטינג לניסוי ציטומטריית הזרימה, השתמשנו בפקד ללא פלואורופור (ללא צבע) בנוסף לבקרות בצבע יחיד <.......

Discussion

LSCs ידועים כעמידים לטיפולים כימותרפיים קונבנציונליים ואנטי-שגשוגיים, ומציאת טיפולים ממוקדים נגד תאים אלה טומנת בחובה הבטחה גדולה בהפחתת התרחשות הישנות ושיפור פרוגנוזה²⁰ של המטופל. מחקר קודם תיאר את השימוש בכתמי התפשטות תאים פלואורסצנטיים כדי לזהות אוכלוסי.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA