Identifizierung ruhender Zellen in einem Zebrafisch-T-Zell-Modell für akute lymphatische Leukämie mittels Zellproliferationsfärbung

Zusammenfassung

Wir verwendeten die Zellproliferationsfärbung, um ruhende Zellen im Zebrafisch-T-Modell für akute lymphatische Leukämie zu identifizieren. Die Färbung wird in nicht teilenden Zellen zurückgehalten und während der Zellproliferation reduziert, was die Selektion ruhender Zellen für die weitere Befragung ermöglicht. Dieses Protokoll bietet ein funktionales Werkzeug, um die Selbsterneuerung im Kontext der zellulären Ruhe zu untersuchen.

Zusammenfassung

Zelluläre Ruhe ist ein Zustand des Wachstumsstillstands oder der verlangsamten Proliferation, der bei normalen und Krebsstammzellen (CSCs) beschrieben wird. Quiescence kann CSCs vor antiproliferativen Chemotherapeutika schützen. In T-Zell-Mausmodellen für akute lymphatische Leukämie (T-ALL) mit patientenabgeleitetem Xenotransplantat (PDX) sind ruhende Zellen mit Behandlungsresistenz und Stammzellen assoziiert. Zellproliferationsfarbstoffe sind beliebte Werkzeuge zur Verfolgung der Zellteilung. Der Fluoreszenzfarbstoff ist kovalent in Amingruppen auf der Membran und Makromolekülen im Inneren der Zelle verankert. Dies ermöglicht die Verfolgung markierter Zellen für bis zu 10 Teilungen, die durch Durchflusszytometrie aufgelöst werden können.

Letztendlich haben Zellen mit den höchsten Proliferationsraten eine geringe Farbstoffretention, da sie bei jeder Zellteilung verdünnt wird, während ruhende, sich langsamer teilende Zellen die höchste Retention aufweisen. Die Verwendung von Zellproliferationsfarbstoffen zur Isolierung ruhender Zellen wurde in T-ALL-Mausmodellen optimiert und beschrieben. Ergänzend zu den bestehenden Mausmodellen bietet das rag2:Myc-abgeleitete Zebrafisch-T-ALL-Modell aufgrund der hohen Häufigkeit leukämischer Stammzellen (LSCs) und der Bequemlichkeit des Zebrafisches für groß angelegte Transplantationsexperimente einen hervorragenden Ort, um die Selbsterneuerung bei T-ALL zu untersuchen.

Hier beschreiben wir den Arbeitsablauf für die Färbung von Zebrafisch-T-ALL-Zellen mit einem Zellproliferationsfarbstoff, die Optimierung der Konzentration des Farbstoffs für Zebrafischzellen, die Passage erfolgreich gefärbter Zellen in vivo und die Entnahme von Zellen mit unterschiedlicher Farbstoffretention durch Sortierung von lebenden Zellen aus transplantierten Tieren. Angesichts des Fehlens gut etablierter Zelloberflächenhersteller für LSCs in T-ALL bietet dieser Ansatz ein funktionelles Mittel, um ruhende Zellen in vivo zu befragen. Für repräsentative Ergebnisse beschreiben wir die Transplantationseffizienz und die LSC-Häufigkeit von Zellen mit hoher und niedriger Farbstoffretention. Diese Methode kann helfen, zusätzliche Eigenschaften ruhender Zellen zu untersuchen, einschließlich des Wirkstoffansprechens, der Transkriptionsprofile und der Morphologie.

Einleitung

Adulte Stammzellen sind für die Regeneration differenzierter Zelltypen in einem bestimmten Organ verantwortlich und liegen überwiegend in einem ruhenden, sich nicht teilenden Zustand vor ^1,2. So bleiben beispielsweise hämatopoetische Stammzellen (HSCs), die das Blut erhalten, weitgehend ruhig, und nur ein kleiner Teil gelangt in den Zellzyklus, um sich selbst zu erneuern oder zu differenzieren, um reife Blutbestandteile zu erzeugen³. In ähnlicher Weise besitzt bei Krebserkrankungen eine seltene Subpopulation von Zellen, die als Krebsstammzellen (CSCs) b....

Protokoll

In diesem Protokoll verwenden wir GFP-markierte Zebrafisch-T-ALL-Zellen, die zuvor im CG1-Stamm erzeugt wurden und daher direkt in den syngenen CG1-Zebrafisch¹⁵ des Empfängers injiziert werden können. Kurz gesagt, Leukämie wurde durch DNA-Mikroinjektion von rag2:Myc und rag2:GFP in einzellige CG1-Zebrafischembryonen erzeugt. Die Tiere wurden ab 3 Wochen nach der Injektion mittels Fluoreszenzmikroskopie auf die Entwicklung von Leukämie überwacht. GFP-positive Leukämiezellen wurden FACS isoliert und seriell in den Empfänger-CG1-Zebrafisch transplantiert, um Klone mit einer hohen LSC-Häufigkeit z....

Diskussion

Es ist bekannt, dass LSCs resistent gegen konventionelle, antiproliferative Chemotherapien sind, und die Suche nach gezielten Therapien gegen diese Zellen ist vielversprechend, um das Auftreten von Rückfällen zu reduzieren und die Patientenprognose zu verbessern²⁰. Frühere Forschungen beschrieben die Verwendung von fluoreszierenden Zellproliferationsfärbungen zur Identifizierung einer kleinen Population ruhender Zellen, die mit Arzneimittelresistenz und Stammz.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA