Identificação de células quiescentes em um modelo de leucemia linfoblástica aguda de células T de peixe-zebra usando coloração de proliferação celular

Resumo

Usamos a coloração de proliferação celular para identificar células quiescentes no modelo de leucemia linfoblástica aguda T de peixe-zebra. A coloração é retida em células que não se dividem e reduzida durante a proliferação celular, permitindo a seleção de células dormentes para interrogação posterior. Este protocolo fornece uma ferramenta funcional para estudar a auto-renovação no contexto da quiescência celular.

Resumo

A quiescência celular é um estado de parada de crescimento ou proliferação lenta que é descrito em células-tronco normais e cancerígenas (CSCs). A quiescência pode proteger as CSCs de drogas quimioterápicas antiproliferativas. Em modelos de camundongos com xenoenxerto derivado de pacientes (PDX) de leucemia linfoblástica aguda de células T (T-ALL), as células quiescentes estão associadas à resistência ao tratamento e à estaminalidade. Os corantes de proliferação celular são ferramentas populares para o rastreamento da divisão celular. O corante fluorescente é covalentemente ancorado em grupos amina na membrana e macromoléculas dentro da célula. Isso permite o rastreamento de células marcadas para até 10 divisões, que podem ser resolvidas por citometria de fluxo.

Em última análise, as células com as maiores taxas de proliferação terão baixa retenção de corante, pois serão diluídas a cada divisão celular, enquanto as células dormentes e de divisão mais lenta terão a maior retenção. O uso de corantes de proliferação celular para isolar células dormentes foi otimizado e descrito em modelos de camundongos T-ALL. Complementar aos modelos de camundongos existentes, o modelo T-ALL de peixe-zebra derivado de rag2: Myc fornece um excelente local para interrogar a auto-renovação em T-ALL devido à alta frequência de células-tronco leucêmicas (LSCs) e à conveniência do peixe-zebra para experimentos de transplante em larga escala.

Aqui, descrevemos o fluxo de trabalho para a coloração de células T-ALL de peixe-zebra com um corante de proliferação celular, otimizando a concentração do corante para células de peixe-zebra, passando células coradas com sucesso in vivo e a coleta de células com níveis variados de retenção de corante por classificação de células vivas de animais transplantados. Dada a ausência de fabricantes de superfície celular bem estabelecidos para LSCs em T-ALL, essa abordagem fornece um meio funcional para interrogar células quiescentes in vivo. Para resultados representativos, descrevemos a eficiência do enxerto e a frequência de LSC de células de alta e baixa retenção de corante. Este método pode ajudar a investigar propriedades adicionais de células quiescentes, incluindo resposta a medicamentos, perfis transcricionais e morfologia.

Introdução

As células-tronco adultas são responsáveis pela regeneração de tipos celulares diferenciados em um determinado órgão e estão predominantemente presentes em um estado dormente e sem divisão ^1,2. Por exemplo, as células-tronco hematopoiéticas (HSCs), que mantêm o sangue, permanecem em grande parte quiescentes, e apenas uma pequena fração entra no ciclo celular para se auto-renovar ou se diferenciar para gerar componentes sanguíneos maduros³. Da mesma forma, nos cânceres, uma subpopulação rara de células chamadas células-tronco cancerígenas (CSCs) possui a....

Protocolo

Neste protocolo, estamos usando células T-ALL de peixe-zebra marcadas com GFP que foram geradas anteriormente na cepa CG1 e, portanto, podem ser injetadas diretamente no peixe-zebra CG1 singênico do receptor¹⁵. Resumidamente, a leucemia foi gerada por microinjeção de DNA de rag2:Myc e rag2:GFP em embriões de peixe-zebra CG1 de célula única. Os animais foram monitorados quanto ao desenvolvimento de leucemia a partir de 3 semanas após a injeção, usando microscopia de fluorescência. As células de leucemia GFP-positivas foram isoladas com FACS e transplantadas em série no peixe-zebra receptor CG1 ....

Discussão

Os LSCs são conhecidos por serem resistentes aos tratamentos convencionais de quimioterapia antiproliferativa, e encontrar terapias direcionadas contra essas células é uma grande promessa na redução da ocorrência de recidiva e na melhoria do prognóstico do paciente²⁰. Pesquisas anteriores descreveram o uso de colorações de proliferação de células fluorescentes para identificar uma pequena população de células quiescentes associadas à resistência a.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA