細胞増殖染色を用いたゼブラフィッシュT細胞急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞の同定

要約

細胞増殖染色を用いて、ゼブラフィッシュT急性リンパ芽球性白血病モデルにおける静止細胞を同定しました。染色は非分裂細胞に保持され、細胞増殖中に減少するため、さらなる調査のために休眠細胞を選択できます。このプロトコルは、細胞の静止の文脈で自己複製を研究するための機能的なツールを提供します。

要約

細胞の静止状態は、正常幹細胞およびがん幹細胞(CSC)で説明される成長停止または増殖の遅延状態です。静止は、CSCを抗増殖性化学療法薬から保護する可能性があります。T細胞性急性リンパ芽球性白血病(T-ALL)患者由来異種移植片(PDX)マウスモデルでは、静止細胞は治療抵抗性および幹細胞性に関連しています。細胞増殖色素は、細胞分裂を追跡するための一般的なツールです。蛍光色素は、メンブレン上のアミン基と細胞内の高分子に共有結合的に固定されています。これにより、標識細胞を最大10分裂まで追跡でき、フローサイトメトリーで解決できます。

最終的に、増殖速度が最も高い細胞は、細胞分裂のたびに希釈されるため、色素の保持が低くなりますが、休眠中の分裂の遅い細胞は保持率が高くなります。休眠細胞を単離するための細胞増殖色素の使用は最適化されており、T-ALLマウスモデルで説明されています。既存のマウスモデルを補完する 、rag2:Myc由来のゼブラフィッシュT-ALLモデルは、白血病幹細胞(LSC)の頻度が高いことと、ゼブラフィッシュが大規模な移植実験に便利であることから、T-ALLの自己複製を調査する優れた場所を提供します。

ここでは、ゼブラフィッシュT-ALL細胞を細胞増殖色素で染色するワークフロー、ゼブラフィッシュ細胞の色素濃度の最適化、 in vivoでの染色に成功した細胞の継代、および移植動物からの生細胞選別によるさまざまなレベルの色素保持を持つ細胞の収集について説明します。T-ALLにはLSCの細胞表面メーカーが確立されていないため、このアプローチはin vivoで静止細胞を調べる機能的な手段を提供します。代表的な結果として、高色素保持細胞と低色素保持細胞の生着効率とLSC頻度について説明します。この方法は、薬物応答、転写プロファイル、形態など、静止細胞のさらなる特性を調べるのに役立ちます。

概要

成体幹細胞は、特定の臓器における分化した細胞型の再生に関与しており、主に休眠中の非分裂状態で存在します^1,2。例えば、血液を維持する造血幹細胞(HSC)は、大部分が静止したままであり、ごく一部だけが細胞周期に入って自己更新または分化して成熟した^{血液成分を生成する}3。同様に、がんでは、がん幹細胞(CSC)と呼ばれる細胞のまれな亜集団が自己複製能力を持ち、悪性腫瘍の長期維持に関与しています⁴。がん幹細胞は、in vivoで静止状態または増殖が遅い状態で存在し、それにより、抗増殖がん治療^{5を回避し、}免疫系⁶によるクリアランスを回避し、酸化ストレスを軽減し、DNA修復経路⁷を強化することができる可能性があります。治療後に残されたCSCの数が少ない場合でも、腫瘍が再増殖し、患者の再発につながる可能性があります⁸。したがって、細胞の静止を理解することは、CSCの潜在的な脆弱性を特定し、それらを標的とする新しい方法の開発に大きな期待を寄せています。

プロトコル

このプロトコルでは、CG1株で以前に生成されたGFP標識ゼブラフィッシュT-ALL細胞を使用しているため、レシピエントの同系CG1ゼブラフィッシュ¹⁵に直接注入することができます。簡単に説明すると、白血病は、単一細胞CG1ゼブラフィッシュ胚への rag2:Myc および rag2:GFP のDNAマイクロインジェクションによって生成されました。動物は、注射後3週間から蛍光顕微鏡を用いて白血病の発症をモニターした。GFP陽性白血病細胞をFACSで単離し、レシピエントCG1ゼブラフィッシュに連続移植して、LSCの頻度が高いクローンを作製しました。プロトコル全体の詳細は、Blackburnら¹⁵によって説明されています。

あるいは、ゼブラフィッシュ胚¹⁷のDNAマイクロインジェクションにより、一次rag2:Myc由来のT-ALLを作製することができる。rag2:MycにGFPなどのrag2駆動型蛍光レポーターをDNAマイクロインジェクションすると、B細胞、T細胞、および混合ALL¹⁸が発生する可能性があります。このプロトコルで使用された白血病クローンは、以....

ディスカッション

LSCは、従来の抗増殖性化学療法治療に耐性があることが知られており、これらの細胞に対する標的療法を見つけることは、再発の発生を減らし、患者の予後を改善する上で大きな期待が寄せられています²⁰。以前の研究では、T-ALL PDXモデル¹³において、薬剤耐性および幹細胞性に関連する静止細胞の小さな集団を同定するための蛍?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
26 G/2” micro-syringe	Hamilton	87930	NA
35 µm filter cap FACS tubes	Falcon	352235	NA
40 µm cell strainer	CELLTREAT	229482	NA
96-well skirted PCR plate	Thermo Fisher Scientific	AB0800	NA
Cell sorter	Sony Biotechnology	SY3200	NA
CellTrace Far Red	Thermo Fisher Scientific	C34564	NA
Conical tubes	VWR	10026-078	NA
DAPI	Thermo Fisher Scientific	62248	NA
DMSO	Sigma-Aldrich	D4818	NA
Dulbecco'sPhosphate-buffered saline (PBS)	Caisson Labs	22110001	NA
Epifluorescence stereo microscope	Nikon	SMZ25	NA
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	12306C	NA
Fish system water	N/A	N/A	0.03-0.05% salinity, pH 6.5-8, buffered with sodium bicarbonate
Microcentrifuge tubes	Thermo Fisher Scientific	C2171	NA
MS-222	Pentaire	TRS-1	tricaine mesylate, an anesthetic
Petri dishes	Corning	07-202-011	NA
Razor blades	American Line	66-0089	NA
Trypan Blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	NA