JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتركة التي تم إنشاؤها من الخلايا العصبية الأولية المعزولة من أجنة الفئران في الأيام الجنينية 15-16 والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتولدة من أدمغة الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-2.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تؤدي العديد من الوظائف التي تدعم صحة الخلايا العصبية وتوازن الجهاز العصبي المركزي. هم مجموعة كبيرة من الخلايا المناعية المرتبطة بنشاط مرض الجهاز العصبي المركزي ، واعتماد الأنماط الظاهرية التفاعلية التي من المحتمل أن تسهم في إصابة الخلايا العصبية أثناء الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد (MS). لا تزال الآليات المتميزة التي تنظم بها الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب التحديات في حل التفاعلات المعقدة في الجسم الحي بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والعوامل البيئية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن النهج في المختبر للاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يظل أداة قيمة لدراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من الفئران والمشاركة في استزراعها. على وجه التحديد ، تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 9-10 أيام في المختبر من ثقافة دبقية مختلطة تم إنشاؤها من متجانسات الدماغ المشتقة من الفئران الوليدية بين أيام ما بعد الولادة 0-2. تم عزل الخلايا العصبية من القشرة الدماغية لأجنة الفئران بين الأيام الجنينية 16-18. بعد 4-5 أيام في المختبر ، تم زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر ، تليها إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة لتشكيل الثقافة المشتركة. يعد التوقيت الدقيق أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول حيث يحتاج كلا النوعين من الخلايا إلى الوصول إلى مرحلة النضج التجريبي لإنشاء الثقافة المشتركة. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الثقافة المشتركة مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة ويمكن أن توفر قراءات متعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المناعي ، والتصوير الحي ، وكذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة تسهل المراقبة المناعية والتوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. وهي تنشأ من الخلايا السلفية لكيس الكريات الحمر التي تستعمر الدماغ أثناء التطور الجنيني4،5،6 ويتم الحفاظ عليها طوال فترة حياة الكائن الحي من خلال التجديد الذاتي ، والذي ينطوي على الانتشار وموت الخلايا المبرمج7. في الحالة المستقرة ، تشعبت الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة وتشارك في مراقبة الأنسجة8،9،10.

تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة عن العديد من مستقبلات سطح الخلية ، والتي تمكنها من الاستجابة السريعة للتغيرات في الجهاز العصبي المركزي11,12 وتعزيز الاستجابات الالتهابية في حالة حدوث عدوى أو إصابة الأنسجة 12,13,14 ، وكذلك أثناء الأمراض التنكسية العصبية 9,15 ، مثل التصلب المتعدد (MS)16,17. تعبر الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا عن مستقبلات لمختلف الناقلات العصبية والببتيدات العصبية18،19،20 ، مما يشير إلى أنها قد تستجيب أيضا للنشاط العصبي وتنظمه21،22. في الواقع ، تتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في أشكال مختلفة من الاتصال ثنائي الاتجاه 8,23 مثل التفاعلات المباشرة بوساطة بروتينات الغشاء أو التفاعلات غير المباشرة من خلال العوامل القابلة للذوبان أو الخلايا الوسيطة23,24.

على سبيل المثال ، يمكن للناقلات العصبية المختلفة التي تفرزها الخلايا العصبية تعديل النشاط العصبي أو الالتهابي للخلايا الدبقية الصغيرة25،26،27. بالإضافة إلى ذلك ، تساعد التفاعلات المباشرة بين الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في الحفاظ على الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة الاستتباب28. على العكس من ذلك ، يمكن للتفاعلات المباشرة للخلايا الدبقية الصغيرة مع الخلايا العصبية تشكيل الدوائر العصبية29 والتأثير على الإشارات العصبية30،31،32. نظرا لأن اضطرابات هذه التفاعلات تحفز فرط استثارة الخلايا العصبية30 وتفاعل الخلايا الدبقية الصغيرة33,34 ، فإن التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة غير المنظمة متورطة كعامل مساهم في الأمراض العصبية33,35. في الواقع ، تم وصف الأمراض الذهانية23,26 والأمراض التنكسية العصبية لإظهار تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة المختلةوظيفيا 33. في حين أن هذه الملاحظات تسلط الضوء على أهمية التواصل بين الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة في الجهاز العصبي المركزي ، فإن الآليات المحددة لكيفية تنظيم هذه التفاعلات للوظائف الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في الصحة والمرض غير معروفة نسبيا.

داخل بيئة معقدة مثل الجهاز العصبي المركزي ، يمكن أن تؤثر عوامل بيئية متعددة على التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة ، مما يحد من القدرة على دراسة التفاعلات الخلوية العابرة في الجسم الحي. هنا ، نقدم نظام زراعة الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر والذي يمكن استخدامه لدراسة التفاعلات الخلوية المباشرة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية. يصف هذا البروتوكول توليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من قشرة الفئران حديثي الولادة بين أيام ما بعد الولادة 0-2 وأيام الفئران الجنينية 16-18 ، على التوالي. ثم يتم استزراع الخلايا العصبية والدبقية الصغيرة في 96 لوحة بئر لإجراء تجارب عالية الإنتاجية في المصب. استخدمنا هذا النهج سابقا لإثبات أن البلعمة الدبقية الصغيرة تحمي الخلايا العصبية من موت الخلايا بوساطة الفوسفاتيديل كولينالمؤكسد 37 ، مما يشير إلى أن هذه الطريقة يمكن أن تساعد في فهم أدوار الخلايا الدبقية الصغيرة في سياق التنكس العصبي والتصلب العصبي المتعدد. وبالمثل ، قد تكون الثقافات المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة مفيدة أيضا للتحقيق في تأثير الحديث المتبادل بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية في سياقات أخرى مثل الالتهابات الفيروسية38 أو إصابة الخلايا العصبية وإصلاحها39. بشكل عام ، تمكن أنظمة الزراعة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر الباحثين من دراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة في بيئة قابلة للتلاعب والتحكم ، والتي تكمل النماذج في الجسم الحي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تم إيواء جميع المستخدمة في هذه الدراسة والتعامل معها بموافقة لجنة رعاية الجامعية (UACC) بجامعة ساسكاتشوان والمجلس الكندي لرعاية (CCAC). أيام ما بعد الولادة 0-2 CD1 تم استخدام ذكور وإناث الفئران والأيام الجنينية 16-18 (E16-18) من الفئران الحوامل CD1 لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية

ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد وقت الثقافات الدبقية والعصبية المختلطة بحيث تنضج الخلايا الدبقية الصغيرة وجاهزة للحصاد في غضون 2 أيام بعد أن يتم زرع الخلايا العصبية في لوحة 96 جيدا.

  1. اعداد
    1. وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة قبل التسخين ، والتي تشمل وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مع نسبة عالية من الجلوكوز مع مصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ ، و 50 وحدة / مل من البنسلين / الستربتومايسين مع 2.92 مجم / مل من L-glutamine ، و 1 مللي متر بيروفات الصوديوم ، و 1x من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 20 mM من HEPES في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. أضف 5 مل من 10 ميكروغرام / مل بولي-إل-أورنيثين (PO) هيدروبروميد إلى كل دورق T-75. قم بتدوير القارورة برفق للتأكد من أن PO يغطي الجزء السفلي من القارورة بالكامل. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: خطوة الطلاء هذه مطلوبة لتسهيل التصاق الخلايا بقوارير T-75.
  2. عزل الأدمغة من الفئران حديثي الولادة P0-P2
    ملاحظة: تعقيم جميع أدوات التشريح والحفاظ على عقم الكواشف. ضمان الالتزام بتقنيات التعقيم طوال الوقت.
    1. قبل البدء في التشريح ، قم برش سطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول أو رذاذ التطهير حيث سيتم التشريح. قم بإعداد مجهر التشريح ووضع طبق بتري تحت المجهر. صب 20 مل من وسائط L-15 من Leibovitz في طبق بتري. حافظ على غطاء طبق بتري أثناء عدم استخدام المجهر لتقليل التلوث.
    2. ضع عدة طبقات من المناشف الورقية ورش المناشف الورقية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد أدوات التشريح (مقص التشريح ، وزوج من الملقط الدقيق ، وملقط الأنسجة) عن طريق رشها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضع الأدوات على المناشف الورقية.
    3. نقل أيام ما بعد الولادة 0-2 الماوس على المناشف الورقية ورش الماوس جيدا مع الإيثانول 70 ٪. قطع رأس الماوس باستخدام مقص التشريح (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    4. أثناء إمساك الرأس برفق ، قم بإنشاء شق خط الوسط في الجمجمة بدءا من الرقبة إلى الأنف. قشر الجمجمة مرة أخرى بملقط الأنسجة للكشف عن الدماغ.
    5. باستخدام ملقط الأنسجة ، أخرج الدماغ برفق عن طريق إدخال الملقط تحت الدماغ ورفع الدماغ من الرأس. ضع الدماغ على الفور في طبق بتري الذي يحتوي على 20 مل من وسائط ليبوفيتز L-15.
    6. تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جذع الدماغ والسحايا بعناية باستخدام زوج من الملقط الدقيق. اجمع الأدمغة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 5 مل من وسائط L-15 من Leibovitz.
  3. تفكك الدماغ والبذر والحفاظ على ثقافة الخلايا الدبقية المختلطة
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. فرم الأدمغة إلى حوالي 1 مم2 قطعة بشفرة مشرط معقمة يمكن التخلص منها. انقل الأدمغة المفرومة بعناية إلى أنبوب معقم جديد سعة 50 مل.
    2. إلى الأدمغة المفرومة ، أضف تركيزا نهائيا قدره 0.25٪ تربسين واحتضن الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. كل 2-3 دقائق ، امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب برفق للمساعدة في تفكك الأنسجة.
    3. من حاضنة CO2 بنسبة 5٪ ، قم بنقل قوارير T-75 التي تحتوي على 5 مل من PO إلى خزانة السلامة الحيوية. تخلص من الفموي واشطف القوارير 3 مرات بمحلول عازل معقم 1x فوسفات (PBS). تأكد من شطف القوارير جيدا لأن الفموي الزائد سام للخلايا.
    4. نقل الأنسجة المهضومة من حمام مائي 37 درجة مئوية إلى خزانة السلامة الحيوية. أضف 5 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة لتحييد التربسين. امزج معلق الأنسجة برفق باستخدام ماصة سعة 10 مل.
    5. ضع مصفاة خلية شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وبلل الشبكة عن طريق سكب ما يقرب من 5 مل من L-15. صب بعناية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية. قم بإزالة المكبس من حقنة معقمة سعة 1 مل ، وطحن الأنسجة في الشبكة باستخدام المكبس للتخلص من كتل الأنسجة ، وتوليد تعليق خلية متجانس.
    6. بشكل دوري ، صب ما يقرب من 5 مل من وسائط L-15 من Leibovitz في شبكة النايلون 70 ميكرومتر واستمر في طحن الأنسجة على الشبكة باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل. عندما يبقى القليل من الأنسجة المرئية على الشبكة ، تخلص من الشبكة وضع تعليق الخلية جانبا.
    7. امزج تعليق الخلية عن طريق سحب الماصة برفق لأعلى ولأسفل. لكل دورق ، أضف كميات متساوية من تعليق الخلية يحتوي على 1-2 دماغ مع وسائط زراعة الدبقية إلى حجم نهائي يبلغ 15 مل.
    8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ طوال الليل. في اليوم التالي ، اغسل القوارير مرتين باستخدام 1x PBS المعقم لإزالة الخلايا غير المتصلة والحطام.
    9. أضف 15 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الكاملة الطازجة إلى الاستزراع واحتضانها عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪. بعد 3 أيام، قم بتغيير نصف الوسائط باستخدام 10 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الطازجة مع 40 نانوغرام/مل من عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF).
      ملاحظة: بعد ذلك، يستعاض عن نصف الوسائط ب 10 مل من وسائط الاستزراع الدبقي الطازجة مع استكمال 40 نانوغرام/مل من MCSF كل 3 أيام. يتم الحفاظ على الثقافة لمدة 8-10 أيام قبل حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة.

2. ثقافة الخلايا العصبية الأولية

  1. اعداد
    1. ذوبان الجليد B-27 زائد الملحق من B-27 بالإضافة إلى نظام الثقافة العصبية. ما قبل التسخين العصبي القاعدي بالإضافة إلى الوسط من B-27 بالإضافة إلى نظام الثقافة العصبية ، 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ، ومصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (FBS) عند 37 درجة مئوية في حمام مائي.
    2. قم بتغطية قوارير T-25 ب 5 مل من 10 ميكروغرام / مل PO واحتضان القوارير لمدة ساعة واحدة على الأقل عند 37 درجة مئوية. إعداد الأدوات واللوازم للتشريح.
      ملاحظة: تسهل خطوة الطلاء هذه التصاق الخلايا بقوارير T-25.
  2. عزل الدماغ عن أجنة الفئران E16-E18
    ملاحظة: تعقيم جميع أدوات التشريح والحفاظ على عقم الكواشف. ضمان الالتزام بتقنيات التعقيم طوال الوقت.
    1. قبل البدء في التشريح ، قم برش سطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول أو رذاذ التطهير حيث سيتم التشريح. قم بإعداد مجهر التشريح ووضع طبق بتري تحت المجهر. صب 20 مل من 1x HBSS في طبق بتري. حافظ على غطاء طبق بتري أثناء عدم استخدام المجهر لتقليل التلوث.
    2. ضع عدة طبقات من المناشف الورقية ورش المناشف الورقية جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإعداد أدوات التشريح (مقص زنبركي ، وزوج من الملقط الدقيق ، وملقط الأنسجة) عن طريق رشها جيدا بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضع الأدوات على المناشف الورقية.
    3. تخدير الفأر الحامل بين أيام الحمل 16-18 باستخدام الأيزوفلوران والقتل الرحيم للفأر عن طريق خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
    4. ضع الماوس على ظهره على قطعة من منشفة ورقية مبللة بالإيثانول بنسبة 70٪. تطهير منطقة البطن مع 70 ٪ من الإيثانول. ارفع جلد أسفل البطن بملقط الأنسجة وقم بإجراء شق على شكل حرف V من هذه النقطة إلى القفص الصدري السفلي بمقص تشريح.
    5. أمسك قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة بملقط الأنسجة وقم بإزالة الأجنة برفق من تجويف البطن. تطهير لفترة وجيزة قرون الرحم التي تحتوي على الأجنة مع الإيثانول 70 ٪.
    6. تشريح جنين واحد من كيسه الفردي في وقت واحد. باستخدام مقص الربيع ، قم بإنشاء شق خط الوسط في الجزء العلوي من الجمجمة ، بدءا من الجزء الخلفي من الرقبة إلى الأنف. ثم ارفع الجمجمة بعيدا عن موقع الشق للكشف عن الدماغ. استخرج الدماغ برفق باستخدام ملقط الأنسجة وانقل الدماغ إلى طبق بتري 10 سم يحتوي على 15 مل من 1x HBSS.
    7. تحت مجهر التشريح ، قم بإزالة جذع الدماغ والسحايا بعناية على جانبي قشرة الدماغ باستخدام زوج من الملقط الدقيق. انقل قشرة الدماغ إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من 1x HBSS وضعه على الجليد.
  3. تفكك الدماغ وبذر الخلايا العصبية القشرية في زراعة الخلايا
    ملاحظة: نفذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية.
    1. فرم الأدمغة إلى حوالي 1 مم2 قطعة في أنبوب مخروطي سعة 50 مل بشفرة مشرط معقمة يمكن التخلص منها. انقل الأدمغة المفرومة إلى أنبوب مخروطي معقم جديد سعة 50 مل.
    2. أضف التربسين إلى الأنبوب بتركيز نهائي قدره 0.25٪. اغمر الأنبوب في حمام ماء ساخن 35-38 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة واخلط الأنبوب برفق لتجانس الأنسجة كل 2-3 دقائق.
    3. أخرج الأنبوب من حمام الماء الساخن. قم بسحب معلق الأنسجة برفق لأعلى ولأسفل لمزيد من فصل الخلايا ، ثم أضف 0.5 مل من FBS المعطل بالحرارة إلى التعليق المتجانس لتحييد نشاط التربسين. تجنب فقاعات الهواء لتقليل السمية للخلايا العصبية.
    4. ضع مصفاة خلية شبكية معقمة من النايلون 70 ميكرومتر على أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل وبلل الشبكة بإضافة ما يقرب من 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلايا الشبكية المصنوعة من النايلون 70 ميكرومتر. باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل ، قم بطحن الأنسجة برفق في مصفاة الخلية. صب بشكل دوري حوالي 5 مل من 1x HBSS مع الاستمرار في الطحن لغسل مصفاة الخلية.
    5. جهاز طرد مركزي الأنبوب المخروطي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. خلال هذا الوقت ، قم بتخفيف مكمل B-27 plus في الوسائط العصبية القاعدية بالإضافة إلى التركيز النهائي 1x لاستخدامه كوسائط عصبية قاعدية كاملة.
    6. تخلص من PO في قوارير T-25 واشطف القوارير ثلاث مرات باستخدام 5 مل من 1x PBS.
    7. صب بعناية لإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية عن طريق سحب 2-3 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة لأعلى ولأسفل برفق. حدد تركيز الخلية وإجمالي عدد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأزرق التريبان. توقع ما يصل إلى 1.0 × 107 خلايا لكل جنين.
    8. صفيحة الخلايا في قوارير T-25 المغلفة ب PO مع ما يقرب من 2.0 × 107 خلايا لكل قارورة في 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة. احتضان زراعة الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪.
    9. قم بإجراء تغيير نصف الوسائط كل 2-3 أيام عن طريق استبدال 2.5 مل من الوسائط من قارورة الثقافة بوسائط عصبية قاعدية كاملة طازجة.

3. الثقافة المشتركة للخلايا العصبية الأولية والخلايا الدبقية الصغيرة

ملاحظة: يجب القيام بجميع الخطوات اللاحقة في خزانة معقمة للسلامة الأحيائية.

  1. زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر
    1. أضف 100 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / مل PO لكل بئر واحتضان القوارير لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية لتغطية الآبار ب PO. اغسل اللوحة ب 1x PBS 3 مرات قبل بذر الخلايا واستنشاق أي سائل متبقي بعد الغسيل الأخير.
    2. يتم حصاد الخلايا العصبية المزروعة في قوارير T-25 للثقافة المشتركة بعد 2-5 أيام في الثقافة. استبدل الوسائط ب 5 مل من محلول Versene 1x مع 0.25٪ تربسين و 1 مجم / مل DNase I لفصل الخلايا العصبية عن القارورة. ضع القوارير داخل الحاضنة لمدة 5-6 دقائق للهضم وقم بتدوير القارورة برفق كل 2-3 دقائق للمساعدة في انفصال الخلايا.
    3. أخرج القارورة من الحاضنة وتحقق مما إذا كانت الخلايا منفصلة تحت المجهر. أضف 0.5 مل من FBS المعطل بالحرارة لتحييد التربسين و DNase I. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل. اغسل القارورة ب 5 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة مرة واحدة لزيادة الخلايا العصبية المجمعة. اجمع كل الخلايا في نفس الأنبوب المخروطي سعة 15 مل.
    4. جهاز طرد مركزي تعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 2-3 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة.
    5. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وأضف وسائط عصبية قاعدية كاملة لتحقيق تركيز نهائي قدره 7.5 × 105 خلايا عصبية / مل. قم بزرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية لكل بئر في لوحة 96 بئرا المطلية ب PO للحصول على 7.5 × 104 خلايا عصبية / بئر. من المتوقع أن ينتج 5-6 ملايين خلية عصبية لكل قارورة.
    6. احتضان الخلايا العصبية في لوحة 96 بئرا بين عشية وضحاها. أضف 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة إلى كل بئر في اليوم التالي.
      ملاحظة: بمجرد أن تظهر الخلايا العصبية نموا مناسبا لعملية الخلايا العصبية (حوالي اليوم 3-4 بعد البذر في 96 صفيحة جيدة) ، فإنها تكون جاهزة للاستزراع المشترك مع الخلايا الدبقية الصغيرة.
  2. العزلة والثقافة المشتركة للخلايا الدبقية الصغيرة
    1. بين 8-10 أيام من زراعة الخلايا الدبقية المختلطة ، اجمع الخلايا الدبقية الصغيرة عن طريق غسل قوارير T-75 برفق باستخدام وسائط استزراع الدبقية في كل قارورة باستخدام ماصة سعة 10 مل ، ونقل الخلايا والوسائط إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. اغسل القوارير مرة أخرى باستخدام وسائط استزراع الدبقية الطازجة سعة 10 مل لفصل الخلايا الدبقية الصغيرة الإضافية عن القوارير وجمع الوسائط. من المتوقع أن يكون العائد 7.5 × 105 الخلايا الدبقية الصغيرة لكل قارورة.
    2. أضف 20 مل من وسائط الاستزراع الدبقية الطازجة المكملة ب 20 نانوغرام / مل MCSF لكل دورق. يمكن حصاد الخلايا الدبقية الصغيرة مرة أو مرتين أكثر إذا تم الحفاظ على ثقافة الدبقية المختلطة.
    3. جهاز طرد مركزي لجمع الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات برفق في 2 مل من الوسائط العصبية القاعدية الكاملة.
    4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم والتريبان الأزرق. أضف وسائط عصبية قاعدية كاملة إلى تركيز نهائي قدره 2.5 × 105 خلايا / مل.
    5. من صفيحة الثقافة العصبية المكونة من 96 بئرا ، قم بإزالة 100 ميكرولتر من الوسائط العصبية القاعدية وأضف 100 ميكرولتر من 2.5 × 105 خلايا / مل تعليق خلية إلى البذور 2.5 × 104 الخلايا الدبقية الصغيرة لكل بئر من 7.5 × 104 الخلايا العصبية. احتضان المزرعة طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ للسماح للخلايا الدبقية الصغيرة بالاستقرار. يمكن الآن استخدام الثقافة المشتركة للتجارب النهائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يظهر مخطط انسيابي يوضح الخطوات الرئيسية لثقافة الخلايا الدبقية المختلطة للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 1 أ. بشكل عام ، من المتوقع وجود خلايا متناثرة وحطام خلوي مفرط في اليوم الأول (الشكل 1 ب). بحلول اليوم 4 ، يجب ملاحظة زيادة عدد الخلايا ، خاصة مع توليد الخل...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا العصبية الأولية للفأر والدبقية الصغيرة الأولية ، والتي تستخدم لاحقا لإنشاء ثقافة مشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يمكن استخدامها لدراسة كيفية تنظيم تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لصحتها الخلوية ووظي?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

يقر JP بدعم التمويل من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا وكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان. تقر YD بدعم التمويل المقدم من صندوق بدء التشغيل لكلية الطب بجامعة ساسكاتشوان ، ومنحة اكتشاف مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة في كندا (RGPIN-2023-03659) ، ومنحة MS Canada Catalyst (1019973) ، ومنحة مؤسسة ساسكاتشوان للبحوث الصحية (6368) ، ومنحة قادة المستقبل لمؤسسة Brain Canada في منحة أبحاث الدماغ الكندية. تم إنشاء الشكل 1 أ والشكل 2 أ والشكل 3 أ باستخدام BioRender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dish Fisher 07-202-011Sterile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401
Dissection microscopeVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 21083027
Macrophage colony stimulating factor Peprotech315-02
Micro-ForcepsRWDF11020-11Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acidsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide SigmaP3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
Spring scissorsRWDS11008-42Autoclaved/Sterile
Surgical bladeFeather08-916-5DSterile
T-25 flasksFisher10-126-9
T-75 flasks Fisher13-680-65
Tissue forcepsCodman30-4218Autoclaved/Sterile
Tissue scissorsRWDS12052-10Autoclaved/Sterile
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2.5%)ThermoFisher Sci15090046
Widefield Immunofluorescence MicroscopeZeiss

References

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537(2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786(2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091(2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977(2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48(2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616(2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, Á Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857(2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677(2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486(2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323(2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359(2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249(2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954(2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702(2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201(2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882(2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534(2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606(2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853(2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564(2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved