توليد وزراعة الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية القشرية

Summary

يصف هذا البروتوكول ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المشتركة التي تم إنشاؤها من الخلايا العصبية الأولية المعزولة من أجنة الفئران في الأيام الجنينية 15-16 والخلايا الدبقية الصغيرة الأولية المتولدة من أدمغة الفئران حديثي الولادة في أيام ما بعد الولادة 1-2.

Abstract

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، تؤدي العديد من الوظائف التي تدعم صحة الخلايا العصبية وتوازن الجهاز العصبي المركزي. هم مجموعة كبيرة من الخلايا المناعية المرتبطة بنشاط مرض الجهاز العصبي المركزي ، واعتماد الأنماط الظاهرية التفاعلية التي من المحتمل أن تسهم في إصابة الخلايا العصبية أثناء الأمراض العصبية المزمنة مثل التصلب المتعدد (MS). لا تزال الآليات المتميزة التي تنظم بها الخلايا الدبقية الصغيرة وظيفة الخلايا العصبية والبقاء على قيد الحياة أثناء الصحة والمرض محدودة بسبب التحديات في حل التفاعلات المعقدة في الجسم الحي بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية والعوامل البيئية الأخرى في الجهاز العصبي المركزي. وبالتالي ، فإن النهج في المختبر للاستزراع المشترك للخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يظل أداة قيمة لدراسة التفاعلات العصبية الدبقية الصغيرة. هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية والخلايا العصبية من الفئران والمشاركة في استزراعها. على وجه التحديد ، تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة بعد 9-10 أيام في المختبر من ثقافة دبقية مختلطة تم إنشاؤها من متجانسات الدماغ المشتقة من الفئران الوليدية بين أيام ما بعد الولادة 0-2. تم عزل الخلايا العصبية من القشرة الدماغية لأجنة الفئران بين الأيام الجنينية 16-18. بعد 4-5 أيام في المختبر ، تم زرع الخلايا العصبية في 96 لوحة بئر ، تليها إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة لتشكيل الثقافة المشتركة. يعد التوقيت الدقيق أمرا بالغ الأهمية لهذا البروتوكول حيث يحتاج كلا النوعين من الخلايا إلى الوصول إلى مرحلة النضج التجريبي لإنشاء الثقافة المشتركة. بشكل عام ، يمكن أن تكون هذه الثقافة المشتركة مفيدة لدراسة تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية الصغيرة ويمكن أن توفر قراءات متعددة ، بما في ذلك الفحص المجهري المناعي ، والتصوير الحي ، وكذلك فحوصات الحمض النووي الريبي والبروتين.

Introduction

الخلايا الدبقية الصغيرة هي بلاعم مقيمة في الأنسجة تسهل المراقبة المناعية والتوازن في الجهاز العصبي المركزي (CNS)^1،2،3. وهي تنشأ من الخلايا السلفية لكيس الكريات الحمر التي تستعمر الدماغ أثناء التطور الجنيني^4،5،6 ويتم الحفاظ عليها طوال فترة حياة الكائن الحي من خلال التجديد الذاتي ، والذي ينطوي على الانتشار وموت الخلايا المبرمج⁷. في الحالة المستقرة ، تشعبت الخلايا الدبقية الصغيرة أثناء الراحة وتشارك في مراقبة الأنسجة^8،

Protocol

تم إيواء جميع المستخدمة في هذه الدراسة والتعامل معها بموافقة لجنة رعاية الجامعية (UACC) بجامعة ساسكاتشوان والمجلس الكندي لرعاية (CCAC). أيام ما بعد الولادة 0-2 CD1 تم استخدام ذكور وإناث الفئران والأيام الجنينية 16-18 (E16-18) من الفئران الحوامل CD1 لهذه الدراسة. يتم سرد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. ثقافة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية

ملاحظة: من الأهمية بمكان تحديد وقت الثقافات الدبقية والعصبية المختلطة بحيث تنضج الخلايا الدبقية الصغيرة وجاهزة للحصاد في غضون 2 أيام بعد أن يتم زرع الخلايا العصبية في لوحة 96 جيدا.

1. اعداد
   1. وسائط الاستزراع الدب....

النتائج

يظهر مخطط انسيابي يوضح الخطوات الرئيسية لثقافة الخلايا الدبقية المختلطة للخلايا الدبقية الصغيرة في الشكل 1 أ. بشكل عام ، من المتوقع وجود خلايا متناثرة وحطام خلوي مفرط في اليوم الأول (الشكل 1 ب). بحلول اليوم 4 ، يجب ملاحظة زيادة عدد الخلايا ، خاصة مع توليد الخل.......

Discussion

توضح هذه المقالة بروتوكولا لعزل وزراعة الخلايا العصبية الأولية للفأر والدبقية الصغيرة الأولية ، والتي تستخدم لاحقا لإنشاء ثقافة مشتركة بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية يمكن استخدامها لدراسة كيفية تنظيم تفاعلات الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية لصحتها الخلوية ووظي?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss