Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Riepilogo

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Abstract

Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti del sistema nervoso centrale (SNC) che svolgono numerose funzioni che supportano la salute neuronale e l'omeostasi del SNC. Sono una delle principali popolazioni di cellule immunitarie associate all'attività della malattia del SNC, adottando fenotipi reattivi che potenzialmente contribuiscono al danno neuronale durante le malattie neurodegenerative croniche come la sclerosi multipla (SM). I meccanismi distinti con cui le microglia regolano la funzione neuronale e la sopravvivenza durante la salute e la malattia rimangono limitati a causa delle sfide nella risoluzione delle complesse interazioni in vivo tra microglia, neuroni e altri fattori ambientali del SNC. Pertanto, l'approccio in vitro di co-coltura di microglia e neuroni rimane uno strumento prezioso per lo studio delle interazioni microglia-neuroni. Qui, presentiamo un protocollo per generare e co-coltivare microglia primarie e neuroni da topi. In particolare, le microglia sono state isolate dopo 9-10 giorni in vitro da una coltura gliale mista stabilita da omogenati cerebrali derivati da topi neonati tra i giorni post-natali 0-2. Le cellule neuronali sono state isolate da cortecce cerebrali di embrioni di topo tra i giorni embrionali 16-18. Dopo 4-5 giorni in vitro, le cellule neuronali sono state seminate in piastre a 96 pozzetti, seguite dall'aggiunta di microglia per formare la co-coltura. Un'attenta tempistica è fondamentale per questo protocollo, poiché entrambi i tipi di cellule devono raggiungere la maturità sperimentale per stabilire la co-coltura. Nel complesso, questa co-coltura può essere utile per studiare le interazioni microglia-neurone e può fornire più letture, tra cui la microscopia a immunofluorescenza, l'imaging dal vivo e i saggi di RNA e proteine.

Introduzione

Le microglia sono macrofagi residenti nei tessuti che facilitano l'immunosorveglianza e l'omeostasi nel sistema nervoso centrale (SNC)^1,2,3. Originano dalle cellule progenitrici eritromieloidi del sacco vitellino che colonizzano il cervello durante lo sviluppo embrionale ^4,5,6 e vengono mantenute per tutta la durata della vita dell'organismo attraverso l'autorinnovamento, che comporta la proliferazione e l'apoptosi⁷. Allo stato stazionario, le microglia a ripo....

Protocollo

Tutti gli animali utilizzati in questo studio sono stati alloggiati e gestiti con l'approvazione dell'University Animal Care Committee (UACC) dell'Università del Saskatchewan e del Canadian Council on Animal Care (CCAC). Per questo studio sono stati utilizzati giorni post-natali 0-2 topi CD1 maschi e femmine e embrioni embrionali giorni 16-18 (E16-18) di topi CD1 gravidi. I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Coltura primaria della microglia

NOTA: È fondamentale cronometrare le colture misti di glia e neuroni in modo c....

Discussione

Questo articolo descrive un protocollo per isolare e coltivare i neuroni primari di topo e la microglia primaria, che vengono successivamente utilizzati per stabilire una co-coltura microglia-neurone che può essere utilizzata per studiare come le interazioni tra microglia e neuroni regolano la loro salute e funzione cellulare. Questo approccio relativamente semplice e accessibile può fornire informazioni critiche sui meccanismi e sugli esiti funzionali delle interazioni dei neuroni della microglia nel SNC.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss