JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, embriyonik 15-16. günlerde fare embriyolarından izole edilen primer nöronal hücrelerden ve doğum sonrası 1-2. günlerde yenidoğan farelerinin beyinlerinden üretilen primer mikrogliadan kurulan bir mikroglia-nöronal ko-kültürü tanımlar.

Özet

Mikroglia, merkezi sinir sisteminin (CNS) dokuda yerleşik makrofajlarıdır ve nöronal sağlığı ve CNS homeostazını destekleyen çok sayıda işlevi yerine getirir. Multipl skleroz (MS) gibi kronik nörodejeneratif hastalıklar sırasında nöronal hasara potansiyel olarak katkıda bulunan reaktif fenotipleri benimseyen, CNS hastalığı aktivitesi ile ilişkili önemli bir bağışıklık hücresi popülasyonudur. Mikroglia'nın sağlık ve hastalık sırasında nöronal fonksiyonu ve sağkalımı düzenlediği farklı mekanizmalar, mikroglia, nöronlar ve diğer CNS çevresel faktörleri arasındaki karmaşık in vivo etkileşimlerin çözülmesindeki zorluklar nedeniyle sınırlı kalmaktadır. Bu nedenle, mikroglia ve nöronların birlikte kültürlenmesine yönelik in vitro yaklaşım, mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemek için değerli bir araç olmaya devam etmektedir. Burada, farelerden birincil mikroglia ve nöronlar üretmek ve birlikte kültürlemek için bir protokol sunuyoruz. Spesifik olarak, mikroglia, doğum sonrası 0-2 günleri arasında yenidoğan farelerden türetilen beyin homojenatlarından oluşturulan karışık bir glia kültüründen in vitro 9-10 gün sonra izole edildi. Nöronal hücreler, embriyonik 16-18. günler arasında fare embriyolarının beyin kortekslerinden izole edildi. 4-5 gün sonra in vitro olarak, nöronal hücreler 96 oyuklu plakalara ekildi, ardından ko-kültürü oluşturmak için mikroglia ilavesi yapıldı. Bu protokol için dikkatli zamanlama çok önemlidir, çünkü her iki hücre tipinin de ko-kültürü oluşturmak için deneysel olgunluğa ulaşması gerekir. Genel olarak, bu ko-kültür, mikroglia-nöron etkileşimlerini incelemek için yararlı olabilir ve immünofloresan mikroskobu, canlı görüntüleme, RNA ve protein tahlilleri dahil olmak üzere çoklu okumalar sağlayabilir.

Giriş

Mikroglia, merkezi sinir sisteminde (CNS) immünosürveyans ve homeostazı kolaylaştıran dokuda yerleşik makrofajlardır1,2,3. Embriyonik gelişim 4,5,6 sırasında beyni kolonize eden yolk kesesi eritromiyeloid progenitör hücrelerden kaynaklanırlar ve proliferasyon ve apoptozuiçeren kendi kendini yenileme yoluyla organizmanın yaşam süresi boyunca korunurlar 7. Kararlı durumda, dinlenme mikrogliaları dallanmış morfolojiye sahiptir ve doku sürveyansına girer 8,9,10.

Mikroglia, CNS'deki değişikliklere hızlı bir şekilde yanıt vermelerini sağlayan çok sayıda hücre yüzeyi reseptörünü eksprese eder11,12 ve enfeksiyonlar veya doku hasarı 12,13,14 ve ayrıca multipl skleroz(MS) gibi nörodejeneratif hastalıklar 9,15 sırasında inflamatuar yanıtları teşvik etmelerini sağlar16,17. Mikroglia ayrıca çeşitli nörotransmiterlere ve nöropeptitlere 18,19,20 reseptörleri eksprese eder, bu da nöronal aktiviteye21,22 yanıt verebileceklerini ve düzenleyebileceklerini düşündürür. Gerçekten de, mikroglia ve nöronlar, zar proteinlerinin aracılık ettiği doğrudan etkileşimler veya çözünür faktörlerveya ara hücreler23,24 aracılığıyla dolaylı etkileşimler gibi çeşitli çift yönlü iletişim biçimlerinde8,23 etkileşime girer.

Örneğin, nöronlar tarafından salgılanan çeşitli nörotransmiterler, mikroglia25,26,27'nin nöroprotektif veya inflamatuar aktivitesini modüle edebilir. Ek olarak, nöronlar ve mikroglia arasındaki doğrudan etkileşimler, mikroglia'nın homeostatik bir durumda tutulmasına yardımcı olur28. Tersine, mikroglia'nın nöronlarla doğrudan etkileşimleri, nöronal devreyi29 şekillendirebilir ve nöronal sinyalleşmeyi 30,31,32 etkileyebilir. Bu etkileşimlerin bozulması nöronların30 hipereksitabilitesini ve mikroglia reaktivitesini33,34 indüklediğinden, düzensiz mikroglia-nöronal etkileşimler nörolojik hastalıklara katkıda bulunan bir faktör olarak rol oynar33,35. Gerçekten de, psikotik23,26 ve nörodejeneratif hastalıkların işlevsiz mikroglia-nöronal etkileşimler sergilediği tanımlanmıştır33. Bu gözlemler CNS'de mikroglia-nöronal iletişimin önemini vurgularken, bu etkileşimlerin sağlık ve hastalıkta mikroglial ve nöronal fonksiyonları nasıl düzenlediğine dair spesifik mekanizmalar nispeten bilinmemektedir.

CNS gibi karmaşık bir ortamda, çoklu çevresel faktörler mikroglia-nöronal etkileşimleri etkileyebilir ve bu da geçici hücresel etkileşimleri in vivo olarak inceleme yeteneğini sınırlar. Burada, mikroglia ve nöronlar arasındaki doğrudan hücresel etkileşimleri incelemek için kullanılabilecek bir in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemi sunuyoruz. Bu protokol, doğum sonrası 0-2. günler ve embriyonik farelerin 16-18. günleri arasında yenidoğan farelerin kortekslerinden birincil mikroglia ve nöronların oluşumunu tanımlar. Nöronlar ve mikroglia daha sonra aşağı akış yüksek verimli deneyler için 96 oyuklu plakalarda birlikte kültürlenir. Daha önce bu yaklaşımı, mikroglia fagositozunun nöronları oksitlenmiş fosfatidilkolin aracılı hücre ölümünden37 koruduğunu göstermek için kullandık, bu da bu yöntemin nörodejenerasyon ve MS bağlamında mikroglia'nın rollerini anlamaya yardımcı olabileceğini düşündürdü. Benzer şekilde, mikroglia-nöronal ko-kültürler, viral enfeksiyonlar38 veya nöronal yaralanma ve onarım39 gibi diğer bağlamlarda mikroglia-nöronal karışmanın etkisini araştırmak için de yararlı olabilir. Genel olarak, in vitro mikroglia-nöronal ko-kültür sistemleri, araştırmacıların in vivo modelleri tamamlayan manipüle edilebilir ve kontrollü bir ortamda mikroglia-nöronal etkileşimleri incelemelerini sağlar.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvanlar, Saskatchewan Üniversitesi Üniversite Hayvan Bakım Komitesi (UACC) ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi'nin (CCAC) onayı ile barındırıldı ve ele alındı. Bu çalışma için doğum sonrası 0-2 CD1 erkek ve dişi fareler ve gebe CD1 farelerinden alınan embriyonik günler 16-18 (E16-18) embriyoları kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Birincil mikroglia kültürü

NOT: Karışık glia ve nöronal kültürleri, nöronların 96 oyuklu bir plakaya ekilmesinden sonraki 2 gün içinde mikrogliaların olgunlaşması ve hasada hazır olması için zamanlamak çok önemlidir.

  1. Hazırlık
    1. % 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumu, 2.92 mg / mL L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat, 1x esansiyel olmayan amino asit ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 mM HEPES ile desteklenmiş yüksek glikozlu Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) içeren ön ısıtmalı tam glia kültürü ortamı.
    2. Her T-75 şişesine 5 mL 10 μg/mL poli-L-ornitin (PO) hidrobromür ekleyin. PO'nun şişenin altını tamamen kapladığından emin olmak için şişeyi hafifçe döndürün. 37 °C'de %5 CO2 inkübatörde en az 1 saat inkübe edin.
      NOT: Bu kaplama adımı, T-75 şişelerine hücre yapışmasını kolaylaştırmak için gereklidir.
  2. P0-P2 yenidoğan farelerden beyin izolasyonu
    NOT: Tüm diseksiyon aletlerini sterilize edin ve reaktiflerin sterilitesini koruyun. Baştan sona aseptik tekniklere bağlı kalın.
    1. Diseksiyona başlamadan önce, diseksiyonun yapılacağı yere tezgahın üzerine %70 etanol veya dezenfekte edici sprey püskürtün. Diseksiyon mikroskobunu kurun ve Petri kabını mikroskobun altına yerleştirin. 20 mL Leibovitz'in L-15 ortamını petri kabına dökün. Kontaminasyonu azaltmak için mikroskop kullanılmadığında Petri kabının kapağını açık tutun.
    2. Birkaç kat kağıt havlu koyun ve kağıt havlulara %70 etanol iyice püskürtün. Diseksiyon aletlerini (diseksiyon makası, bir çift mikro forseps ve doku forsepsi) üzerlerine %70 etanol püskürterek ve aletleri kağıt havluların üzerine sererek hazırlayın.
    3. Doğum sonrası 0-2 gün fareyi kağıt havlulara aktarın ve fareye% 70 etanol iyice püskürtün. Diseksiyon makası kullanarak farenin kafasını kesin (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
    4. Başı nazikçe tutarken, boyundan başlayarak buruna kadar kafatasında orta hat kesisi oluşturun. Beyni ortaya çıkarmak için kafatasını doku forseps ile geriye doğru soyun.
    5. Doku forsepslerini kullanarak, forsepsleri beynin altına sokarak beyni nazikçe dışarı çıkarın ve beyni kafadan kaldırın. Beyni hemen 20 mL Leibovitz'in L-15 ortamını içeren Petri kabına yerleştirin.
    6. Diseksiyon mikroskobu altında, bir çift mikro forseps kullanarak beyin sapını ve meninksleri dikkatlice çıkarın. Beyinleri, 5 mL Leibovitz'in L-15 ortamını içeren 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
  3. Beyin ayrışması, karışık glia kültürünün tohumlanması ve sürdürülmesi
    NOT: Sonraki tüm adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
    1. Steril tek kullanımlık neşter bıçağı ile beyinleri yaklaşık 1 mm2 parçaya doğrayın. Kıyılmış beyinleri dikkatlice 50 mL'lik yeni bir steril tüpe aktarın.
    2. Kıyılmış beyinlere,% 0.25 tripsin son konsantrasyonunu ekleyin ve dokuyu 37 ° C'lik bir su banyosunda 20 dakika inkübe edin. Her 2-3 dakikada bir, doku ayrışmasına yardımcı olmak için tüpü hafifçe ters çevirerek çözeltiyi karıştırın.
    3. %5 CO2 inkübatörden 5 mL PO içeren T-75 şişelerini biyogüvenlik kabinine aktarın. PO'yu atın ve şişeleri steril 1x fosfat tampon çözeltisi (PBS) ile 3 kez durulayın. Fazla PO hücreler için toksik olduğundan şişeleri iyice duruladığınızdan emin olun.
    4. Sindirilen dokuyu 37 °C'lik su banyosundan biyogüvenlik kabinine aktarın. Tripsini nötralize etmek için 5 mL tam glia kültür ortamı ekleyin. Doku süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipet kullanarak nazikçe karıştırın.
    5. Steril 50 mL'lik konik bir tüpe steril 70 μm'lik bir naylon ağ hücre süzgeci yerleştirin ve yaklaşık 5 mL L-15 dökerek ağı ıslatın. Hücre süspansiyonunu hücre süzgecinden dikkatlice boşaltın. Pistonu steril 1 mL'lik bir şırıngadan çıkarın, doku kümelerinden kurtulmak için pistonu kullanarak dokuyu ağa öğütün ve homojenize bir hücre süspansiyonu oluşturun.
    6. Periyodik olarak, yaklaşık 5 mL Leibovitz'in L-15 ortamını 70 μm naylon ağa dökün ve 1 mL şırınga pistonu ile dokuyu ağ üzerinde öğütmeye devam edin. Ağ üzerinde çok az görünür doku kaldığında veya hiç kalmadığında, ağı atın ve hücre süspansiyonunu bir kenara koyun.
    7. Hücre süspansiyonunu hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her şişeye, glia kültür ortamı ile 1-2 beyin içeren eşit hacimlerde hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir son hacme ekleyin.
    8. Hücreleri gece boyunca %5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, bağlanmamış hücreleri ve kalıntıları temizlemek için şişeleri steril 1x PBS ile iki kez yıkayın.
    9. Kültüre 15 mL taze tam glia kültür ortamı ekleyin ve% 5 CO2 inkübatörde 37 ° C'de inkübe edin. 3 gün sonra, ortamın yarısını 40 ng / mL makrofaj koloni uyarıcı faktör (MCSF) ile desteklenmiş 10 mL taze glia kültür ortamı ile değiştirin.
      NOT: Daha sonra, ortamın yarısı, her 3 günde bir 40 ng / mL MCSF ile desteklenmiş 10 mL taze glia kültür ortamı ile değiştirilir. Kültür, mikroglia hasat edilmeden önce 8-10 gün boyunca muhafaza edilir.

2. Birincil nöron kültürü

  1. Hazırlık
    1. B-27 artı takviyesini B-27 artı nöronal kültür sisteminden çözün. Bir su banyosunda 37 ° C'de B-27 artı nöronal kültür sistemi, 1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS) ve ısıyla etkisiz hale getirilmiş fetal sığır serumundan (FBS) önceden ısıtılmış nörobazal artı ortam.
    2. T-25 şişelerini 5 mL 10 μg/mL PO ile kaplayın ve şişeleri 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin. Diseksiyon için aletleri ve malzemeleri hazırlayın.
      NOT: Bu kaplama adımı, T-25 şişelerine hücre yapışmasını kolaylaştırır.
  2. E16-E18 fare embriyolarından beyin izolasyonu
    NOT: Tüm diseksiyon aletlerini sterilize edin ve reaktiflerin sterilitesini koruyun. Baştan sona aseptik tekniklere bağlı kalın.
    1. Diseksiyona başlamadan önce, diseksiyonun yapılacağı yere tezgahın üzerine %70 etanol veya dezenfekte edici sprey püskürtün. Diseksiyon mikroskobunu kurun ve Petri kabını mikroskobun altına yerleştirin. Petri kabına 20 mL 1x HBSS dökün. Kontaminasyonu azaltmak için mikroskop kullanılmadığında Petri kabının kapağını açık tutun.
    2. Birkaç kat kağıt havlu koyun ve kağıt havlulara %70 etanol iyice püskürtün. Diseksiyon aletlerini (yaylı makas, bir çift mikro forseps ve doku forsepsleri) üzerlerine %70 etanol püskürterek ve aletleri kağıt havluların üzerine koyarak hazırlayın.
    3. Hamile bir fareyi 16-18 gebelik günleri arasında izofluran kullanarak uyuşturun ve fareyi servikal çıkık ile ötenazi yapın (kurumsal olarak onaylanmış protokolleri izleyerek).
    4. Fareyi %70 etanole batırılmış bir kağıt havlu parçasının üzerine sırt üstü yatırın. Karın bölgesini% 70 etanol ile dezenfekte edin. Alt karın derisini doku forseps ile kaldırın ve diseksiyon makası ile bu noktadan alt göğüs kafesine V şeklinde bir kesi yapın.
    5. Embriyoları içeren uterus boynuzlarını doku forseps ile tutun ve embriyoları karın boşluğundan nazikçe çıkarın. Embriyo içeren uterus boynuzlarını% 70 etanol ile kısaca dezenfekte edin.
    6. Bir seferde bir embriyoyu kendi kesesinden inceleyin. Yaylı makas kullanarak, boynun arkasından başlayarak buruna kadar kafatasının üst kısmında bir orta hat kesisi oluşturun. Ardından, beyni ortaya çıkarmak için kafatasını kesi bölgesinden kaldırın. Beyni doku forsepsleri ile nazikçe çıkarın ve beyni 15 mL 1x HBSS içeren 10 cm'lik bir Petri kabına aktarın.
    7. Diseksiyon mikroskobu altında, beyin sapını ve beyin kortekslerinin her iki yanındaki meninksleri bir çift mikro forseps ile dikkatlice çıkarın. Beyin kortekslerini 10 mL 1x HBSS içeren 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve buzun üzerine yerleştirin.
  3. Hücre kültüründe beyin ayrışması ve kortikal nöronların tohumlanması
    NOT: Sonraki tüm adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
    1. Steril tek kullanımlık neşter bıçağı ile beyinleri 50 mL konik tüpte yaklaşık 1 mm2 parçaya doğrayın. Kıyılmış beyinleri yeni bir steril 50 mL konik tüpe aktarın.
    2. Tüpe% 0.25'lik bir son konsantrasyonla tripsin ekleyin. Tüpü 15 dakika boyunca 35-38 ° C sıcak su banyosuna daldırın ve her 2-3 dakikada bir dokuyu homojenize etmek için tüpü hafifçe karıştırın.
    3. Tüpü sıcak su banyosundan çıkarın. Hücreleri daha fazla ayırmak için doku süspansiyonunu nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin, ardından tripsin aktivitesini nötralize etmek için homojenize süspansiyona 0.5 mL ısıyla inaktive edilmiş FBS ekleyin. Nöronal hücrelere toksisiteyi en aza indirmek için hava kabarcıklarından kaçının.
    4. Steril 50 mL'lik bir konik tüpe steril bir 70 μm naylon ağ hücre süzgeci yerleştirin ve yaklaşık 5 mL nörobazal ortam ekleyerek ağı ıslatın. Hücre süspansiyonunu 70 μm naylon örgü hücre süzgecinden süzün. 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak, dokuyu hücre süzgecine nazikçe öğütün. Hücre süzgecini yıkamak için öğütmeye devam ederken periyodik olarak yaklaşık 5 mL 1x HBSS dökün.
    5. Konik tüpü 300 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Bu süre zarfında, tam nörobazal ortam olarak kullanmak için nörobazal artı ortamdaki B-27 artı takviyesini 1x nihai konsantrasyona seyreltin.
    6. PO'yu T-25 şişelerine atın ve şişeleri 5 mL 1x PBS ile üç kez durulayın.
    7. Süpernatanı çıkarmak için dikkatlice boşaltın ve 2-3 mL tam nörobazal ortamı nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini yeniden süspanse edin. Hücre konsantrasyonunu ve toplam hücre sayısını bir hemositometre ve tripan mavisi ile belirleyin. Embriyo başına 1.0 x 107 hücreye kadar bekleyin.
    8. PO kaplı T-25 şişelerindeki hücreleri, 5 ml tam nörobazal ortamda şişe başına yaklaşık 2.0 x10 7 hücre ile kaplayın. Hücre kültürünü 37 °C'de% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin.
    9. Kültür şişesinden 2,5 mL besiyerini yeni yapılmış tam nörobazal besiyeri ile değiştirerek her 2-3 günde bir yarım besiyeri değişikliği yapın.

3. Birincil nöronların ve mikrogliaların ko-kültürü

NOT: Sonraki tüm adımlar steril bir biyogüvenlik kabininde yapılmalıdır.

  1. 96 oyuklu plakalarda nöronların tohumlanması
    1. Kuyucuk başına 100 μL 10 μg/mL PO ekleyin ve kuyucukları PO ile kaplamak için şişeleri 37 °C'de en az 1 saat inkübe edin. Hücreleri tohumlamadan önce plakayı 1x PBS ile 3 kez yıkayın ve son yıkamadan sonra kalan sıvıyı aspire edin.
    2. T-25 şişelerinde yetiştirilen nöronlar, kültürde 2-5 gün sonra ko-kültür için hasat edilir. Nöronları şişeden ayırmak için ortamı 5 mL 1x Versene çözeltisi% 0.25 tripsin ve 1 mg / mL DNaz I ile değiştirin. Şişeleri sindirim için 5-6 dakika inkübatörün içine yerleştirin ve hücre ayrılmasına yardımcı olmak için şişeyi her 2-3 dakikada bir hafifçe döndürün.
    3. Şişeyi inkübatörden çıkarın ve hücrelerin mikroskop altında ayrılıp ayrılmadığını kontrol edin. Tripsin ve DNaz I'i nötralize etmek için 0.5 mL ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS ekleyin. Hücreleri 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Toplanan nöronları en üst düzeye çıkarmak için şişeyi 5 mL tam nörobazal ortamla bir kez yıkayın. Tüm hücreleri aynı 15 mL konik tüpte toplayın.
    4. Hücre süspansiyonunu 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini 2-3 mL tam nörobazal ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.
    5. Hücreleri bir hemositometre ile sayın ve 7.5 x 105 nöron / mL'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için tam nörobazal ortam ekleyin. 7.5 x 104 nöron / kuyucuk elde etmek için PO kaplı 96 oyuklu plakadaki her bir oyuka 100 μL hücre süspansiyonu tohumlayın. Şişe başına 5-6 milyon nöron verimi bekleniyor.
    6. Nöronları gece boyunca 96 oyuklu bir plakada inkübe edin. Ertesi gün her oyuğa 100 μL tam nörobazal ortam ekleyin.
      NOT: Nöronlar uygun nörit süreç büyümesini gösterdiğinde (96 oyuklu plakalarda tohumlamadan yaklaşık 3-4. gün), mikroglia ile ko-kültür için hazırdırlar.
  2. İzolasyon ve mikroglia-nöronal ko-kültür
    1. 8-10 günlük karışık glia ekimi arasında, T-75 şişelerini her bir şişede glia kültür ortamı ile 10 mL'lik bir pipetle nazikçe yıkayarak mikroglia toplayın ve hücreleri ve ortamı steril 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Şişelerden ek mikrogliaları ayırmak ve ortamı toplamak için şişeleri 10 mL taze glia kültür ortamı ile tekrar yıkayın. Şişe başına 7.5 x 105 mikroglia verim beklenmektedir.
    2. Her şişeye 20 ng / mL MCSF ile desteklenmiş 20 mL taze glia kültür ortamı ekleyin. Karışık glia kültürü korunursa mikroglia bir veya iki kez daha hasat edilebilir.
    3. Hücre koleksiyonunu 300 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti 2 mL tam nörobazal ortamda nazikçe yeniden süspanse edin.
    4. Hücreleri bir hemositometre ve tripan mavisi ile sayın. 2.5 x 105 hücre / mL'lik bir nihai konsantrasyona tam nörobazal ortam ekleyin.
    5. 96 oyuklu nöronal kültür plakasından, 100 μL nörobazal ortamı çıkarın ve 7.5 x 10 4nöronluk oyukluk bir oyuk başına 2.5 x 104 mikroglia tohumlamak için 100 μL 2.5 x 105 hücre / mL hücre süspansiyonu ekleyin. Mikroglia'nın çökelmesine izin vermek için kültürü gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Ko-kültür artık aşağı akış deneyleri için kullanılabilir.

Sonuçlar

Mikroglia için karışık glia kültürünün temel adımlarını gösteren bir akış şeması Şekil 1A'da gösterilmiştir. Genel olarak, 1. günde seyrek hücreler ve aşırı hücresel kalıntı beklenir (Şekil 1B). 4. günde, özellikle uzun morfolojileri ile gösterildiği gibi, yapışık astrositlerin oluşumuyla birlikte artan hücre sayısı gözlenmelidir (Şekil 1C). Astrositlerin üzerinde veya ortamda yüzen küçü...

Tartışmalar

Bu makale, daha sonra mikroglia ve nöron etkileşimlerinin hücresel sağlıklarını ve işlevlerini nasıl düzenlediğini incelemek için kullanılabilecek bir mikroglia-nöronal ko-kültür oluşturmak için kullanılan fare birincil nöronlarını ve birincil mikroglialarını izole etmek ve kültürlemek için bir protokolü açıklamaktadır. Bu nispeten basit ve erişilebilir yaklaşım, CNS'deki mikroglia nöron etkileşimlerinin mekanizmaları ve işlevsel sonuçları hakkında kritik bilgiler sağlayabilir.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

JP, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi ve Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden fon desteğini kabul eder. YD, Saskatchewan Üniversitesi Tıp Fakültesi Başlangıç Fonu, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi Keşif Hibesi (RGPIN-2023-03659), MS Kanada Katalizör Hibesi (1019973), Saskatchewan Sağlık Araştırma Vakfı Kuruluş Hibesi (6368) ve Brain Canada Vakfı Kanada Beyin Araştırmalarında Geleceğin Liderleri Hibesi. Şekil 1A, Şekil 2A ve Şekil 3A BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Petri dish Fisher 07-202-011Sterile
1x VerseneGibco15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System Gibco A3653401
Dissection microscopeVWR
DNase IRoche11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11960-044
Fetal Bovine Serum ThermoFisher Sci12483-020
HBSS (10x)Gibco14065-056
HemacytometerHausser Scientific1475
HEPES ThermoFisher Sci15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)Fisher Scientific 21083027
Macrophage colony stimulating factor Peprotech315-02
Micro-ForcepsRWDF11020-11Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acidsCytivaSH3023801
PBS (10x)ThermoFisher SciAM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)Gibco103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide SigmaP3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)Gibco11360-070
Spring scissorsRWDS11008-42Autoclaved/Sterile
Surgical bladeFeather08-916-5DSterile
T-25 flasksFisher10-126-9
T-75 flasks Fisher13-680-65
Tissue forcepsCodman30-4218Autoclaved/Sterile
Tissue scissorsRWDS12052-10Autoclaved/Sterile
Trypan Blue Thermofisher Sci 15250-061
Trypsin (2.5%)ThermoFisher Sci15090046
Widefield Immunofluorescence MicroscopeZeiss

Referanslar

  1. Yin, J., Valin, K. L., Dixon, M. L., Leavenworth, J. W. The role of microglia and macrophages in CNS homeostasis, autoimmunity, and cancer. J Immunol Res. 2017, 1-12 (2017).
  2. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  3. Ginhoux, F., Prinz, M. Origin of microglia: Current concepts and past controversies. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (8), a020537 (2015).
  4. Dermitzakis, I., et al. Origin and emergence of microglia in the CNS-an interesting (hi)story of an eccentric cell. Curr Issues Mol Biol. 45 (3), 2609-2628 (2023).
  5. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  6. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  7. Askew, K., et al. Coupled proliferation and apoptosis maintain the rapid turnover of microglia in the adult brain. Cell Rep. 18 (2), 391-405 (2017).
  8. Vidal-Itriago, A., et al. Microglia morphophysiological diversity and its implications for the CNS. Front Immunol. 13, 997786 (2022).
  9. Wendimu, M. Y., Hooks, S. B. Microglia phenotypes in aging and neurodegenerative diseases. Cells. 11 (13), 2091 (2022).
  10. Hanisch, U. K., Kettenmann, H. Microglia: Active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain. Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).
  11. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35 (1), 441-468 (2017).
  12. Zhao, J. F., et al. Research progress on the role of microglia membrane proteins or receptors in neuroinflammation and degeneration. Front Cell Neurosci. 16, 831977 (2022).
  13. Yang, I., Han, S. J., Kaur, G., Crane, C., Parsa, A. T. The role of microglia in central nervous system immunity and glioma immunology. J Clin Neurosci. 17 (1), 6-10 (2010).
  14. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Front Cell Neurosci. 14, 198 (2020).
  15. Doens, D., Fernández, P. L. Microglia receptors and their implications in the response to amyloid β for Alzheimer's disease pathogenesis. J Neuroinflammation. 11 (1), 48 (2014).
  16. Block, M. L., Zecca, L., Hong, J. S. Microglia-mediated neurotoxicity: Uncovering the molecular mechanisms. Nat Rev Neurosci. 8 (1), 57-69 (2007).
  17. Fischer, M. T., et al. NADPH oxidase expression in active multiple sclerosis lesions in relation to oxidative tissue damage and mitochondrial injury. Brain. 135 (3), 886-899 (2012).
  18. Marinelli, S., Basilico, B., Marrone, M. C., Ragozzino, D. Microglia-neuron crosstalk: Signaling mechanism and control of synaptic transmission. Semin Cell Dev Biol. 94, 138-151 (2019).
  19. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  20. Carniglia, L., et al. Neuropeptides and microglial activation in inflammation, pain, and neurodegenerative diseases. Mediators Inflamm. 2017, 5048616 (2017).
  21. Zhao, S., Umpierre, A. D., Wu, L. J. Tuning neural circuits and behaviors by microglia in the adult brain. Trends Neurosci. 47 (3), 181-194 (2024).
  22. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: New roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  23. Haidar, M. A., et al. Crosstalk between microglia and neurons in neurotrauma: An overview of the underlying mechanisms. Curr Neuropharmacol. 20 (11), 2050-2065 (2022).
  24. Cserép, C., Pósfai, B., Dénes, &. #. 1. 9. 3. ;. Shaping neuronal fate: Functional heterogeneity of direct microglia-neuron interactions. Neuron. 109 (2), 222-240 (2021).
  25. Pocock, J. M., Kettenmann, H. Neurotransmitter receptors on microglia. Trends Neurosci. 30 (10), 527-535 (2007).
  26. Eyo, U. B., Wu, L. J. Bidirectional microglia-neuron communication in the healthy brain. Neural Plast. 2013, 456857 (2013).
  27. Strosznajder, J. B., Czapski, G. A. Glutamate and GABA in microglia-neuron cross-talk in Alzheimer's disease. Int J Mol Sci. 22 (21), 11677 (2021).
  28. Lyons, A., et al. CD200 ligand-receptor interaction modulates microglial activation in vivo and in vitro A role for IL-4. J Neurosci. 27 (31), 8309-8313 (2007).
  29. Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. Microglia: Actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function. Trends Neurosci. 36 (4), 209-217 (2013).
  30. Merlini, M., et al. Microglial Gi-dependent dynamics regulate brain network hyperexcitability. Nat Neurosci. 24 (1), 19-23 (2021).
  31. Chen, Z., et al. Microglial displacement of inhibitory synapses provides neuroprotection in the adult brain. Nat Commun. 5 (1), 4486 (2014).
  32. Cantaut-Belarif, Y., et al. Microglia control the glycinergic but not the GABAergic synapses via prostaglandin E2 in the spinal cord. J Cell Biol. 216 (9), 2979-2989 (2017).
  33. Szepesi, Z., Manouchehrian, O., Bachiller, S., Deierborg, T. Bidirectional microglia-neuron communication in health and disease. Front Cell Neurosci. 12, 323 (2018).
  34. Chamera, K., Trojan, E., Szuster-Głuszczak, M., Basta-Kaim, A. The potential role of dysfunctions in neuron-microglia communication in the pathogenesis of brain disorders. Curr Neuropharmacol. 18 (5), 408-430 (2020).
  35. Gao, C., Jiang, J., Tan, Y., Chen, S. Microglia in neurodegenerative diseases: Mechanism and potential therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 359 (2023).
  36. Brisch, R., et al. The role of microglia in neuropsychiatric disorders and suicide. Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci. 272 (6), 929-945 (2022).
  37. Dong, Y., et al. Oxidized phosphatidylcholines found in multiple sclerosis lesions mediate neurodegeneration and are neutralized by microglia. Nat Neurosci. 24 (4), 489-503 (2021).
  38. Alvarez-Carbonell, D., et al. Cross-talk between microglia and neurons regulates HIV latency. PLoS Pathog. 15 (12), e1008249 (2019).
  39. Lorenzen, K., et al. Microglia induce neurogenic protein expression in primary cortical cells by stimulating PI3K/AKT intracellular signaling in vitro. Mol Biol Rep. 48 (1), 563-584 (2021).
  40. Güler, B. E., Krzysko, J., Wolfrum, U. Isolation and culturing of primary mouse astrocytes for the analysis of focal adhesion dynamics. STAR Protoc. 2 (4), 100954 (2021).
  41. Tomassoni-Ardori, F., Hong, Z., Fulgenzi, G., Tessarollo, L. Generation of functional mouse hippocampal neurons. Bio Protoc. 10 (15), e3702 (2020).
  42. Viviani, B. Preparation and coculture of neurons and glial cells. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 2 (Unit 2.7), (2006).
  43. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-culture of neurons and microglia. Curr Protoc Toxicol. 74, 11.24.1-11.24.17 (2017).
  44. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. J Neuroinflammation. 17 (1), 155 (2020).
  45. Carroll, J. A., Foliaki, S. T., Haigh, C. L. A 3D cell culture approach for studying neuroinflammation. J Neurosci Methods. 358, 109201 (2021).
  46. Baxter, P. S., et al. Microglial identity and inflammatory responses are controlled by the combined effects of neurons and astrocytes. Cell Rep. 34 (12), 108882 (2021).
  47. Luchena, C., et al. A neuron, microglia, and astrocyte triple co-culture model to study Alzheimer's disease. Front Aging Neurosci. 14, 844534 (2022).
  48. Park, J., et al. A 3D human triculture system modeling neurodegeneration and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Nat Neurosci. 21 (7), 941-951 (2018).
  49. Vahsen, B. F., et al. Human iPSC co-culture model to investigate the interaction between microglia and motor neurons. Sci Rep. 12 (1), 12606 (2022).
  50. Giacomelli, E., et al. Human stem cell models of neurodegeneration: from basic science of amyotrophic lateral sclerosis to clinical translation. Cell Stem Cell. 29 (1), 11-35 (2022).
  51. Yong, V. W. Microglia in multiple sclerosis: protectors turn destroyers. Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).
  52. Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: relationship to neurodegeneration and therapeutics. J Neuroinflammation. 19 (1), 45 (2022).
  53. Dong, Y., Lozinski, B. M., Silva, C., Yong, V. W. Studying the microglia response to oxidized phosphatidylcholine in primary mouse neuron culture and mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (4), 100853 (2021).
  54. Anderson, S. R., et al. Neuronal apoptosis drives remodeling states of microglia and shifts in survival pathway dependence. eLife. 11, e76564 (2022).
  55. Harry, G. J., McPherson, C. A. Microglia: Neuroprotective and neurodestructive properties. Handbook of Neurotoxicity. , 109-132 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 209Mikroglian ronin vitroko k lt rbeyinmultipl skleroz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır