生成和共培养小鼠原代小胶质细胞和皮质神经元

摘要

该方案描述了从胚胎第 15-16 天从小鼠胚胎中分离的原代神经元细胞和出生后第 1-2 天从新生小鼠大脑产生的原代小胶质细胞建立的小胶质细胞-神经元共培养物。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 的组织驻留巨噬细胞，执行支持神经元健康和 CNS 稳态的许多功能。它们是与 CNS 疾病活动相关的免疫细胞的主要群体，采用反应性表型，在慢性神经退行性疾病（如多发性硬化症 （MS））期间可能导致神经元损伤。由于解决小胶质细胞、神经元和其他 CNS 环境因素之间复杂的 体内 相互作用的挑战，小胶质细胞在健康和疾病期间调节神经元功能和存活的不同机制仍然有限。因此，共培养小胶质细胞和神经元的 体外 方法仍然是研究小胶质细胞-神经元相互作用的宝贵工具。在这里，我们提出了一种从小鼠生成和共培养原代小胶质细胞和神经元的方案。具体来说，在出生后 0-2 天之间，从来自新生小鼠脑匀浆的混合胶质细胞培养物 中 分离出小胶质细胞。在胚胎第 16-18 天之间从小鼠胚胎的脑皮层中分离出神经元细胞。 体外 4-5 天后，将神经元细胞接种在 96 孔板中，然后加入小胶质细胞以形成共培养物。仔细的时间安排对于该方案至关重要，因为两种细胞类型都需要达到实验成熟度才能建立共培养。总体而言，这种共培养可用于研究小胶质细胞-神经元相互作用，并且可以提供多种读数，包括免疫荧光显微镜检查、实时成像以及 RNA 和蛋白质检测。

引言

小胶质细胞是组织驻留的巨噬细胞，可促进中枢神经系统 （CNS） 的免疫监视和稳态^1,2,3。它们起源于卵黄囊红髓样祖细胞，在胚胎发育过程中定植于大脑 ^4,5,6，^并通过自我更新（涉及增殖和细胞凋亡）在生物体的整个生命周期中维持⁷。在稳态时，静息小胶质细胞分化形态并参与组织监测 ^8,9,10。

小胶质细胞表达许多细胞表面受体，这使它们能够快速响应 CNS 的变化^11,12，^并在感染或组织损伤的情况下促进炎症反应 12,13,14，以及^<....

研究方案

本研究中使用的所有动物均经萨斯喀彻温大学动物护理委员会 （UACC） 和加拿大动物护理委员会 （CCAC） 批准进行饲养和处理。本研究使用怀孕 CD1 小鼠出生后 0-2 天 CD1 雄性和雌性小鼠以及胚胎第 16-18 天 （E16-18） 胚胎。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 原代小胶质细胞培养

注意：对混合神经胶质细胞和神经元培养物进行计时至关重要，以便小胶质细胞在将神经元接种到 96 孔板后 2 天内成熟并准备好收获。

1. 制备
   1. 预热完全神经胶质细胞培养基，包括高葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），其中补充有 10% 热灭活胎牛血清、50 U/mL 青霉素/链霉素和 2.92 mg/mL L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1x 非必需氨基酸和 20 mM HEPES，在 37 °C 水浴中。
   2. 向每个 T-75 培养瓶中加入 5 mL 10 μg/mL 聚-L-鸟氨酸 （PO） 氢溴酸盐。轻轻旋转培养瓶，确保 PO 完全覆盖培养瓶底部。在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育至少 1 小时。
      注：此包被步骤是促进细胞粘附到 T-75 培养瓶上所必需的。
2. 从 P0-P2 ....

讨论

本文介绍了一种分离和培养小鼠原代神经元和原代小胶质细胞的方案，随后用于建立小胶质细胞-神经元共培养物，可用于研究小胶质细胞和神经元相互作用如何调节其细胞健康和功能。这种相对简单易行的方法可以为 CNS 中小胶质细胞神经元相互作用的机制和功能结果提供关键见解。

为了实现最佳的共培养，该方案中的几个关键方面需要格外小心。在脑分离期间（步骤 1.2.6 ?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss