生成和共培养小鼠原代小胶质细胞和皮质神经元

摘要

该方案描述了从胚胎第 15-16 天从小鼠胚胎中分离的原代神经元细胞和出生后第 1-2 天从新生小鼠大脑产生的原代小胶质细胞建立的小胶质细胞-神经元共培养物。

摘要

小胶质细胞是中枢神经系统 （CNS） 的组织驻留巨噬细胞，执行支持神经元健康和 CNS 稳态的许多功能。它们是与 CNS 疾病活动相关的免疫细胞的主要群体，采用反应性表型，在慢性神经退行性疾病（如多发性硬化症 （MS））期间可能导致神经元损伤。由于解决小胶质细胞、神经元和其他 CNS 环境因素之间复杂的 体内 相互作用的挑战，小胶质细胞在健康和疾病期间调节神经元功能和存活的不同机制仍然有限。因此，共培养小胶质细胞和神经元的 体外 方法仍然是研究小胶质细胞-神经元相互作用的宝贵工具。在这里，我们提出了一种从小鼠生成和共培养原代小胶质细胞和神经元的方案。具体来说，在出生后 0-2 天之间，从来自新生小鼠脑匀浆的混合胶质细胞培养物 中 分离出小胶质细胞。在胚胎第 16-18 天之间从小鼠胚胎的脑皮层中分离出神经元细胞。 体外 4-5 天后，将神经元细胞接种在 96 孔板中，然后加入小胶质细胞以形成共培养物。仔细的时间安排对于该方案至关重要，因为两种细胞类型都需要达到实验成熟度才能建立共培养。总体而言，这种共培养可用于研究小胶质细胞-神经元相互作用，并且可以提供多种读数，包括免疫荧光显微镜检查、实时成像以及 RNA 和蛋白质检测。

引言

小胶质细胞是组织驻留的巨噬细胞，可促进中枢神经系统 （CNS） 的免疫监视和稳态^1,2,3。它们起源于卵黄囊红髓样祖细胞，在胚胎发育过程中定植于大脑 ^4,5,6，^并通过自我更新（涉及增殖和细胞凋亡）在生物体的整个生命周期中维持⁷。在稳态时，静息小胶质细胞分化形态并参与组织监测 ^8,9,10。

小胶质细胞表达许多细胞表面受体，这使它们能够快速响应 CNS 的变化^11,12，^并在感染或组织损伤的情况下促进炎症反应 12,13,14，以及在神经退行性疾病^{期间 9,15}，如多发性硬化症 （MS）^16,17.小胶质细胞还表达各种神经递质和神经肽的受体 ^18,19,20，这表明它们也可能响应并调节神经元活动 ^21,22。事实上，小胶质细胞和神经元以各种形式的双向通讯相互作用 ^8,23，例如由膜蛋白介导的直接相互作用或通过可溶性因子或中间细胞的间接相互作用^23,24。

例如，神经元分泌的各种神经递质可以调节小胶质细胞的神经保护或炎症活性 25,26,27。此外，神经元和小胶质细胞之间的直接相互作用有助于将小胶质细胞维持在稳态²⁸。相反，小胶质细胞与神经元的直接相互作用可以塑造神经元回路²⁹ 并影响神经元信号转导 30,31,32。由于这些相互作用的破坏会诱导神经元的过度兴奋³⁰ 和小胶质细胞反应性^33,34，^失调的小胶质细胞-神经元相互作用被认为是神经系统疾病的一个促成因素^33,35。事实上，精神病^23,26 和神经退行性疾病已被描述为表现出功能失调的小胶质细胞-神经元相互作用³³。虽然这些观察结果强调了小胶质细胞-神经元通讯在 CNS 中的重要性，但这些相互作用如何调节健康和疾病中小胶质细胞和神经元功能的具体机制相对未知。

在 CNS 等复杂环境中，多种环境因素会影响小胶质细胞-神经元相互作用，从而限制了研究 体内瞬时细胞相互作用的能力。在这里，我们提出了一种 体外 小胶质细胞-神经元共培养系统，可用于研究小胶质细胞和神经元之间的直接细胞相互作用。该方案分别描述了出生后第 0-2 天和胚胎小鼠第 16-18 天之间从新生小鼠皮层产生原代小胶质细胞和神经元。然后将神经元和小胶质细胞在 96 孔板中共培养，用于下游高通量实验。我们之前使用这种方法来证明小胶质细胞吞噬作用保护神经元免受氧化磷脂酰胆碱介导的细胞死亡³⁷，这表明这种方法可以帮助理解小胶质细胞在神经变性和 MS 中的作用。同样，小胶质细胞-神经元共培养也可能有助于研究小胶质细胞-神经元串扰在其他情况下的影响，例如病毒感染³⁸ 或神经元损伤和修复³⁹。总体而言， 体外小 胶质细胞-神经元共培养系统使研究人员能够在可操作和受控的环境中研究小胶质细胞-神经元相互作用，这与 体内 模型相辅相成。

研究方案

本研究中使用的所有动物均经萨斯喀彻温大学动物护理委员会 （UACC） 和加拿大动物护理委员会 （CCAC） 批准进行饲养和处理。本研究使用怀孕 CD1 小鼠出生后 0-2 天 CD1 雄性和雌性小鼠以及胚胎第 16-18 天 （E16-18） 胚胎。材料 表中列出了试剂和所用设备的详细信息。

1. 原代小胶质细胞培养

注意:对混合神经胶质细胞和神经元培养物进行计时至关重要，以便小胶质细胞在将神经元接种到 96 孔板后 2 天内成熟并准备好收获。

1. 制备
   1. 预热完全神经胶质细胞培养基，包括高葡萄糖的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 （DMEM），其中补充有 10% 热灭活胎牛血清、50 U/mL 青霉素/链霉素和 2.92 mg/mL L-谷氨酰胺、1 mM 丙酮酸钠、1x 非必需氨基酸和 20 mM HEPES，在 37 °C 水浴中。
   2. 向每个 T-75 培养瓶中加入 5 mL 10 μg/mL 聚-L-鸟氨酸 （PO） 氢溴酸盐。轻轻旋转培养瓶，确保 PO 完全覆盖培养瓶底部。在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育至少 1 小时。
      注:此包被步骤是促进细胞粘附到 T-75 培养瓶上所必需的。
2. 从 P0-P2 新生小鼠中分离大脑
   注意:对所有解剖工具进行消毒并保持试剂的无菌性。确保全程遵守无菌技术。
   1. 在开始解剖之前，在将要进行解剖的地方用 70% 乙醇或消毒喷雾喷洒台面。设置解剖显微镜并将培养皿置于显微镜下。将 20 mL 的 Leibovitz 的 L-15 培养基倒入培养皿中。不使用显微镜时，请保持培养皿的盖子打开，以减少污染。
   2. 放下几层纸巾，用 70% 乙醇彻底喷洒纸巾。准备解剖工具（解剖剪刀、一对微型镊子和组织镊子），用 70% 乙醇彻底喷洒，然后将工具放在纸巾上。
   3. 将出生后 0-2 天的小鼠转移到纸巾上，并用 70% 乙醇彻底喷洒小鼠。使用解剖剪刀将小鼠斩首（遵循机构批准的方案）。
   4. 轻轻握住头部，在颅骨上做一个从颈部到鼻子的中线切口。用组织镊子将头骨向后剥开，露出大脑。
   5. 使用组织镊子，将镊子插入大脑下方，轻轻地将大脑舀出，然后将大脑从头部提起。立即将大脑放入含有 20 mL Leibovitz's L-15 培养基的培养皿中。
   6. 在解剖显微镜下，使用一对微型镊子小心地去除脑干和脑膜。将大脑收集在含有 5 mL Leibovitz's L-15 培养基的 50 mL 锥形管中。
3. 脑解离、接种和维持混合胶质细胞培养
   注:在生物安全柜中执行所有后续步骤。
   1. 用无菌的一次性手术刀刀片将大脑切成约 1 毫米² 的小块。小心地将切碎的大脑转移到新的 50 mL 无菌试管中。
   2. 向切碎的大脑中加入终浓度为 0.25% 胰蛋白酶的胰蛋白酶，并将组织在 37 °C 水浴中孵育 20 分钟。每 2-3 分钟，轻轻倒置试管以混合溶液，以帮助组织解离。
   3. 从 5% CO₂ 培养箱中，将含有 5 mL PO 的 T-75 培养瓶转移到生物安全柜中。丢弃 PO 并用无菌 1x 磷酸盐缓冲溶液 （PBS） 冲洗培养瓶 3 次。确保彻底冲洗培养瓶，因为过量的 PO 对细胞有毒。
   4. 将消化的组织从 37 °C 水浴转移到生物安全柜中。加入 5 mL 完全神经胶质培养基以中和胰蛋白酶。使用 10 mL 移液器轻轻混合组织悬液。
   5. 将无菌 70 μm 尼龙网孔池过滤器放在无菌 50 mL 锥形管上，倒入大约 5 mL L-15 润湿网孔。小心地将细胞悬液倒入细胞过滤器中。从无菌 1 mL 注射器中取出柱塞，使用柱塞将组织研磨成网片以去除组织团块，并产生匀浆细胞悬液。
   6. 定期将大约 5 mL 的 Leibovitz L-15 培养基倒入 70 μm 尼龙网中，然后用 1 mL 注射器柱塞继续研磨网上的组织。当网状物上几乎没有可见组织时，丢弃网状物并将细胞悬液放在一边。
   7. 通过轻轻上下移液来混合细胞悬液。向每个培养瓶中加入等体积的含有 1-2 个脑的细胞悬液和神经胶质细胞培养基，最终体积为 15 mL。
   8. 将细胞在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育过夜。第二天，用无菌 1x PBS 洗涤培养瓶两次，以去除未附着的细胞和碎片。
   9. 向培养物中加入 15 mL 新鲜完全神经胶质细胞培养基，并在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育。3 天后，用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基更换一半的培养基，其中补充有 40 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子 （MCSF）。
      注意:此后，每 3 天用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基替换一半的培养基，并补充 40 ng/mL 的 MCSF。在收获小胶质细胞之前，培养物维持 8-10 天。

2. 原代神经元培养

1. 制备
   1. 解冻来自 B-27 plus 神经元培养系统的 B-27 plus 补充剂。来自 B-27 的 neurobasal plus 培养基加神经元培养系统、1x Hank 平衡盐溶液 （HBSS） 和热灭活胎牛血清 （FBS），在 37 °C 下在水浴中。
   2. 用 5 mL 10 μg/mL PO 包被 T-25 培养瓶，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。 准备用于解剖的器械和用品。
      注:该包被步骤有助于细胞粘附到 T-25 培养瓶上。
2. 从 E16-E18 小鼠胚胎中分离大脑
   注意:对所有解剖工具进行消毒并保持试剂的无菌性。确保全程遵守无菌技术。
   1. 在开始解剖之前，在将要进行解剖的地方用 70% 乙醇或消毒喷雾喷洒台面。设置解剖显微镜并将培养皿置于显微镜下。将 20 mL 的 1x HBSS 倒入培养皿中。不使用显微镜时，请保持培养皿的盖子打开，以减少污染。
   2. 放下几层纸巾，用 70% 乙醇彻底喷洒纸巾。准备解剖工具（弹簧剪刀、一对微型镊子和组织镊子），用 70% 乙醇彻底喷洒，然后将工具放在纸巾上。
   3. 在妊娠第 16-18 天之间使用异氟醚麻醉怀孕的小鼠，并通过宫颈脱位对小鼠实施安乐死（遵循机构批准的方案）。
   4. 将鼠标仰卧在一块浸泡了 70% 乙醇的纸巾上。用 70% 乙醇消毒腹部区域。用组织镊子提起下腹部的皮肤，并用解剖剪刀从该点到下肋骨做一个 V 形切口。
   5. 用组织镊子抓住含有胚胎的子宫角，轻轻地从腹腔中取出胚胎。用 70% 乙醇对含有胚胎的子宫角进行短暂消毒。
   6. 一次从其单个囊中解剖一个胚胎。使用弹簧剪刀，在颅骨顶部创建一个中线切口，从脖子后部开始到鼻子。然后，将头骨从切口部位提起，露出大脑。用组织镊子轻轻舀出大脑，然后将大脑转移到含有 15 mL 1x HBSS 的 10 厘米培养皿中。
   7. 在解剖显微镜下，用一对微型镊子小心地去除脑干和脑皮层两侧的脑膜。将脑皮层转移到含有 10 mL 1x HBSS 的 50 mL 锥形管中，并置于冰上。
3. 细胞培养中大脑解离和皮层神经元接种
   注:在生物安全柜中执行所有后续步骤。
   1. 用无菌一次性手术刀刀片在 50 mL 锥形管中将大脑切成约 1 毫米² 块。将切碎的大脑转移到新的无菌 50 mL 锥形管中。
   2. 将胰蛋白酶加入试管中，终浓度为 0.25%。将试管浸入 35-38 °C 热水浴中 15 分钟，然后每 2-3 分钟轻轻混合试管以匀浆组织。
   3. 将管子从热水浴中取出。轻轻上下移液组织悬液以进一步解离细胞，然后向匀浆悬浮液中加入 0.5 mL 热灭活的 FBS 以中和胰蛋白酶活性。避免气泡，以尽量减少对神经元细胞的毒性。
   4. 将无菌 70 μm 尼龙网状细胞过滤器放在无菌 50 mL 锥形管上，并加入大约 5 mL 的 neurobasal 培养基润湿网状细胞。通过 70 μm 尼龙网状细胞过滤器过滤细胞悬液。使用 1 mL 注射器柱塞，将组织轻轻研磨到细胞过滤器中。定期倒入大约 5 mL 的 1x HBSS，同时继续研磨以清洗细胞过滤器。
   5. 将锥形管在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 在此期间，将 Neurobasal plus 培养基中的 B-27 plus 补充剂稀释至最终浓度的 1 倍，以用作完整的 neurobasal 培养基。
   6. 丢弃 T-25 烧瓶中的 PO，并用 5 mL 的 1x PBS 冲洗烧瓶 3 次。
   7. 小心倒出以去除上清液，并通过轻轻上下吹打 2-3 mL 完全神经基底培养基来重悬细胞沉淀。用血细胞计数器和台盼蓝测定细胞浓度和总细胞数。预计每个胚胎最多有 1.0 x 10⁷ 个细胞。
   8. 将细胞接种在 PO 包被的 T-25 培养瓶中，每个培养瓶约 2.0 x 10⁷ 个细胞，溶于 5 ml 完全神经基底培养基中。将细胞培养物在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育。
   9. 每 2-3 天更换一次半培养基，用新鲜制备的完全神经基底培养基替换培养瓶中的 2.5 mL 培养基。

3. 原代神经元和小胶质细胞的共培养

注:所有后续步骤均应在无菌生物安全柜中完成。

1. 在 96 孔板中接种神经元
   1. 每孔加入 100 μL 10 μg/mL PO，并在 37 °C 下孵育烧瓶至少 1 小时，以用 PO 包被孔。在接种细胞之前，用 1x PBS 洗涤板 3 次，并在最后一次洗涤后吸出任何剩余的液体。
   2. 在 T-25 培养瓶中生长的神经元在培养 2-5 天后收获用于共培养。用 5 mL 含 0.25% 胰蛋白酶和 1 mg/mL DNase I 的 1x Versene 溶液更换培养基，以从培养瓶中分离神经元。将培养瓶放入培养箱中 5-6 分钟进行消化，每 2-3 分钟轻轻旋转一次培养瓶，以帮助细胞分离。
   3. 从培养箱中取出培养瓶，在显微镜下检查细胞是否脱落。加入 0.5 mL 热灭活的 FBS 以中和胰蛋白酶和 DNase I。将细胞转移到 15 mL 锥形管中。用 5 mL 完全 neurobasal 培养基洗涤培养瓶一次，以最大限度地收集神经元。将所有细胞收集在同一个 15 mL 锥形管中。
   4. 将细胞悬液在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 弃去上清液，将细胞沉淀轻轻重悬于 2-3 mL 完全神经基底培养基中。
   5. 用血细胞计数器计数细胞，并加入完整的神经基础培养基，以达到 7.5 x 10⁵ 个神经元/mL 的最终浓度。将 100 μL 细胞悬液接种到 PO 包被的 96 孔板中的每个孔中，以获得 7.5 x 10⁴ 个神经元/孔。预计每个培养瓶的产量为 5-600 万个神经元。
   6. 将神经元在 96 孔板中孵育过夜。第二天向每个孔中加入 100 μL 完全 neurobasal 培养基。
      注意:一旦神经元表现出适当的神经突突生长（在 96 孔板中接种后第 3-4 天左右），它们就可以与小胶质细胞共培养。
2. 分离和小胶质细胞-神经元共培养
   1. 在混合胶质细胞培养 8-10 天之间，用 10 mL 移液管轻轻洗涤每个培养瓶中装有神经胶质细胞培养基的 T-75 培养瓶，收集小胶质细胞，然后将细胞和培养基转移到无菌的 50 mL 锥形管中。用 10 mL 新鲜神经胶质细胞培养基再次洗涤培养瓶，以从培养瓶中分离额外的小胶质细胞并收集培养基。预计每个培养瓶的产量为 7.5 x 10⁵ 个小胶质细胞。
   2. 向每个培养瓶中加入 20 mL 补充有 20 ng/mL MCSF 的新鲜神经胶质细胞培养基。如果维持混合胶质细胞培养物，小胶质细胞可以再收获一次或两次。
   3. 将细胞收集物在 4 °C 下以 300 x g 离心 5 分钟。 小心去除上清液，并将沉淀轻轻重悬于 2 mL 完全 neurobasal 培养基中。
   4. 用血细胞计数器和台盼蓝计数细胞。添加完全的 neurobasal 培养基，终浓度为 2.5 x 10⁵ 个细胞/mL。
   5. 从 96 孔神经元培养板中，去除 100 μL 神经基底培养基，并加入 100 μL 2.5 x 10⁵ 个细胞/mL 细胞悬液，以每孔 7.5 x 10⁴ 个神经元接种 2.5 x 10⁴ 个小胶质细胞。将培养物在 37 °C 下在 5% CO₂ 培养箱中孵育过夜，以使小胶质细胞沉淀。共培养物现在可用于下游实验。

结果

图 1A 显示了小胶质细胞混合胶质细胞培养关键步骤的流程图。总体而言，预计第 1 天会出现稀疏的细胞和过多的细胞碎片（图 1B）。到第 4 天，应观察到细胞数量增加，尤其是贴壁星形胶质细胞的产生，如其细长的形态所示（图 1C）。可以在星形胶质细胞顶部观察到一些小胶质细胞，或者作为漂浮在培养基中的小圆形细胞。到第...

讨论

本文介绍了一种分离和培养小鼠原代神经元和原代小胶质细胞的方案，随后用于建立小胶质细胞-神经元共培养物，可用于研究小胶质细胞和神经元相互作用如何调节其细胞健康和功能。这种相对简单易行的方法可以为 CNS 中小胶质细胞神经元相互作用的机制和功能结果提供关键见解。

为了实现最佳的共培养，该方案中的几个关键方面需要格外小心。在脑分离期间（步骤 1.2.6 ?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Petri dish	Fisher	07-202-011	Sterile
1x Versene	Gibco	15040-066
B-27 Plus Neuronal Culture System	Gibco	A3653401
Dissection microscope	VWR
DNase I	Roche	11284932001
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11960-044
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher Sci	12483-020
HBSS (10x)	Gibco	14065-056
Hemacytometer	Hausser Scientific	1475
HEPES	ThermoFisher Sci	15630080
Leibovitz’s L-15 Medium (1x)	Fisher Scientific	21083027
Macrophage colony stimulating factor	Peprotech	315-02
Micro-Forceps	RWD	F11020-11	Autoclaved/Sterile
Non-essential amino acids	Cytiva	SH3023801
PBS (10x)	ThermoFisher Sci	AM9625
Penicillin Streptomycin Glutamine (100x)	Gibco	103780-16
Poly-L-ornithine hydrobromide	Sigma	P3655-100MG
Sodium pyruvate (100 mM)	Gibco	11360-070
Spring scissors	RWD	S11008-42	Autoclaved/Sterile
Surgical blade	Feather	08-916-5D	Sterile
T-25 flasks	Fisher	10-126-9
T-75 flasks	Fisher	13-680-65
Tissue forceps	Codman	30-4218	Autoclaved/Sterile
Tissue scissors	RWD	S12052-10	Autoclaved/Sterile
Trypan Blue	Thermofisher Sci	15250-061
Trypsin (2.5%)	ThermoFisher Sci	15090046
Widefield Immunofluorescence Microscope	Zeiss